肠杆菌科丝氨酸蛋白酶自动转运家族研究进展

张俊琪,瞿涤

1. 复旦大学上海医学院病原生物系,上海 200032; 2. 复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室,上海 200032

肠杆菌科丝氨酸蛋白酶自动转运家族(serine protease auto-transporters ofEnterobacteriaceae,SPATEs)蛋白仅存在于致病性肠道杆菌中,通过自动转运的方式(又称细菌的Ⅴ型分泌系统)分泌到菌体外。大部分SPATE蛋白都是细菌分泌的重要毒力因子[1,2]。1994年,Provence和Curtiss[3]首次在禽致病性大肠埃希菌(avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)上发现了第1个SPATE蛋白:温度敏感血凝素(temperature-sensitive hemagglutinin,Tsh)。迄今已有超过20种的SPATE蛋白在大肠埃希菌、志贺菌、柠檬酸杆菌和沙门菌等致病性肠道杆菌中陆续发现(表1)。

表1常见致病性肠道杆菌产生的肠杆菌科丝氨酸蛋白酶自动转运家族

Tab.1CommonSPATEsproducedbypathogenicenterobacteria

OrganismDiseaseProteinFunctionE. coli EHEC Blood diarrhea,hemorrhagic colitisEpeAEspP(α,β,γ,δ)UnknownProteolytic toxin, cytotoxinEPECDiarrheaEspCEnterotoxin, proteolytic toxinEAECDiarrheaPetEnterotoxinPicHemagglutinin, mucinase, cytotoxin?STECDiarrhea, renal failureEspIUnknownPssACytotoxin, proteaseUPECUrinary tract infectionPicUProteaseSatProteolytic toxin, vacuolating cytotoxinTsh_UPECUnkownETECDiarrheaAidA-B7AUnknownEatAUnknownHuman septic E. coli Wound infections,septicemiaHbp Heme-sequestering protein E. coli?EaaAUnknownEaaCUnknownAPECColibacillosis, septicemiaTsh_APECHemagglutinin, adhesin for RBCs, Hb, ECMVat APECVacuolating cytotoxinShigella flexneriShigellosisSepAProtease, inflammation, invasionSigAProteolytic toxin, cytotoxinPicHemagglutinin, mucinase,cytopathic effects on intestinal cells?IcsAMediator of intracellular motilitySalmonella bongoriDiarrheaBoaUnkown

SPATE蛋白的结构特点：①N端为可剪切的信号肽序列(N-terminal signal sequence);②中部为载乘结构域(passenger domain),是该蛋白家族发挥各种生物学功能的主要结构域;③C端为转运单位(translocator unit)。

C端转运单位的结构特点是在空间上由数个β折叠形成一个桶状结构,插入革兰阴性菌外膜的磷脂双分子层,协助与之相连的载乘结构域自菌体周浆间隙向胞外分泌,从而剪切、加工为成熟的毒性蛋白。SPATE蛋白的载乘结构域具有丝氨酸蛋白酶共有的催化结构域GDSGS,因此这类蛋白均具有蛋白水解活性。研究发现,在肠道杆菌中只有致病菌才产生SPATE蛋白,而SPATE蛋白是这些细菌培养上清液中含量最高的蛋白,与细菌的毒力密切相关。

随着结构化学和生物化学的发展,人们对SPATE蛋白的了解也越来越深,同时关于这类蛋白的一些新问题也在不断出现。本文就SPATE蛋白的空间结构、转运分泌过程、不同SPATE蛋白之间的结构差异以及生物学功能进行综述,并对今后SPATE蛋白的研究方向进行讨论和展望。

1 N端信号肽序列与SPATE前体蛋白原的跨内膜转运

SPATE蛋白在菌体胞质中首先以N端带有一段信号肽序列的前体蛋白原(pre-pro-protein)的形式出现,而后通过secretion(sec)系统的转运跨过细胞膜，进入周浆间隙。生物信息学研究表明,SPATE信号肽一级结构具有sec依赖的信号肽特点,在功能上自N端起可划分为3个区域:正电荷氨基酸残基组成区、含疏水核心基团区〔与信号识别颗粒(signal recognition particle,SRP)或分泌蛋白B(secretion protein B,SecB)的结合部位,一级结构相对保守〕及具有信号肽酶识别位点的保守区[4],结构见图1。

图1肠杆菌科丝氨酸蛋白酶自动转运家族结构示意图

Fig.1StructureofSPATE

SPATE信号肽由48～59个氨基酸残基组成,与只含18～26个氨基酸残基的典型信号肽序列相比,这种加长的信号肽可能与转运大分子蛋白有关〔SPATE蛋白的相对分子质量(Mr)均超过100×103〕。目前关于SPATE蛋白与sec系统的相互作用存在2种假说:SecB依赖学说和SecB非依赖学说。前者认为SPATE蛋白通过信号肽与分子伴侣SecB识别结合后,由SecB将前体蛋白原转运至位于细菌内膜上的分泌蛋白YEG(secretion proteins Y,E and G,secYEG);后者认为这些不同寻常的长信号肽序列的识别需要一些不同于SecB的辅助蛋白,如SRP的参与,SecB在其中不起作用。SecB蛋白在转运过程中的作用有待进一步阐明[5,6]。

此外,对肠出血性大肠埃希菌(enterohaemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)的分泌蛋白P(Escherichiacolisecretion protein P,EspP)和肠黏附性大肠埃希菌(enteroaggregativeEscherichiacoli,EAEC)的质粒编码毒素(plasmid-encoded toxin,Pet)研究发现,加长的信号肽结构除了帮助SPATE前体蛋白原转运至细菌内膜外,还可有效延缓SPATE蛋白通过细菌内膜的速度,从而避免已穿过内膜的前体蛋白在菌体周浆间隙发生错误折叠,影响后续的分泌过程[7,8]。

2 C端转运单位与SPATE前体蛋白在外膜上的加工处理和转运

当SPATE前体蛋白原穿过细菌内膜后,N端信号肽被切割,前体蛋白进入周浆间隙,载乘区域进行部分空间折叠。目前研究表明,至少有1个分子伴侣降解蛋白(degradation protein,DegP)在结构上与SPATE蛋白C端转运结构域具有高度同源性[9-11],提示DegP参与协助前体蛋白从细菌周浆间隙穿越细菌外膜并分泌到体外的过程。

目前发现所有SPATE蛋白C端转运单位均具有十分相似的一级结构和高级结构:由277个氨基酸残基组成,在空间上折叠成1个β桶状结构。因此认为,SPATE蛋白可通过自身转运单位形成的β桶状结构直接插入外膜的磷脂双分子层,从而协助载乘区域的转运。外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)YaeT/Omp85并没有参与其中或者只是起到十分微弱的作用[11,12]。在SPATE蛋白的结构中,C端转运单位在结构上保守性最高,各SPATE蛋白一级结构氨基酸组成和结构的同源性超过60%。

在连接载乘区域与C端转运单位的数个β折叠之间有个α螺旋形成的铰链区,其中14个氨基酸残基组成的序列EVNNLNKRMGDLRD非常保守,是蛋白酶水解位点,也是整个蛋白中最长的保守氨基酸序列。研究证实,这一切割位点由结构非常保守的2个连续天冬氨酸残基组成,在空间上位于转运部分，即β桶状结构的内部(孔内)。当其残基突变时,尽管不能阻断转运单位插入细菌外膜中,但可严重降低或阻止载乘区域向菌体细胞外分泌。由于铰链区在装配和维持β桶状结构的稳定性、保证载乘蛋白的正确折叠、协助载乘蛋白靶向定位到外膜以及从外膜向外分泌的过程中扮演着十分重要的角色,因此其改变往往会引起SPATE蛋白不能正常分泌和成熟。目前有研究人员正考虑将其作为抗菌药物作用的新靶点。

当SPATE蛋白通过外膜到达菌体细胞表面,其C端转运单位被切割,成熟的SPATE蛋白载乘区域分泌到菌体细胞外,从而发挥各自的生物学功能。

3 中部载乘区域中的保守结构变化决定着SPATE蛋白功能的多样性

通过分泌、剪切和正确折叠后,成熟的SPATE蛋白载乘结构域(主要功能区)具有活性。虽然SPATE蛋白在功能上千差万别,但在载乘结构域的一级结构和空间构象上却有很多相似之处。根据SPATE蛋白一级结构的特点,推测SPATE蛋白的二级结构易形成平行的β折叠,从而在空间上易形成β螺旋桶状结构。该假设已经通过血红蛋白蛋白酶(haemoglobin protease,Hbp)的晶体结构分析得以证实[13]。对Hbp结构分析表明,载乘区域主干结构由相同的24个右手β螺旋构成,每个螺旋由3个β片层结构组成，这些β片层结构被一个个回环结构分割。在一级结构的组成上,β片层结构中氨基酸组成和排列比回环结构更保守。除了β螺旋这样保守的主干核心结构外,Hbp载乘区域的N端还可形成2个球状功能域。区域1由载乘区的第1～256氨基酸残基组成,折叠成胰岛素样蛋白酶,这与成熟载乘区域的蛋白水解活性密切相关;区域2由载乘区的第481～556残基组成,结构上与几丁质酶chitin蛋白的结合域很相似,推测与该蛋白的黏附功能有关。

对已知的SPATE蛋白进行生物信息学分析得出[6],在载乘区域1 200个左右的氨基酸残基中,约有173个是保守的,它们在维持SPATE蛋白空间结构的稳定性和功能的特殊性上可能发挥非常重要作用。这些保守的氨基酸残基在三级结构上主要分布在以下2个区域:①在173个保守氨基酸残基中,有122个是疏水性氨基酸,总是一个个重叠排列分布在β螺旋的主干结构中,在一定程度上说明非极化作用在维持主干β螺旋结构的稳定性和分割主干与球状功能域上很重要。②主干结构的顶端有1个与球状功能域的分割面(interface),这一分割面在SPATE蛋白还铆在细菌外膜层上时已经突出于细菌细胞表面,扮演底物识别位点的角色。这个界面也有5个保守模块(conserved motif):第1个保守模块是由H125、D153和G257DSGS组成的催化三聚体,三聚体中第1个丝氨酸残基与蛋白水解作用有关[14,15];另外4个保守模块在空间上与催化三聚体保持固定距离,影响丝氨酸蛋白酶活性。模块DFS距离催化三聚体大约1.1 nm;模块DxLHKxGxGxL和LKxGxGxVxL与模块RLxKxVxE大约相距0.8 nm。这些保守模块可能与蛋白的功能密切相关。

此外,SPATE蛋白载乘区域C端第950～1 048氨基酸残基的组成也十分保守,这一保守模块是载乘区域二级结构β折叠形成的核心催化域,控制着载乘区域折叠发生的频率和穿越菌体外膜的速度。

除了在结构上具有高度相似性外,SPATE蛋白的载乘区域有各自严格的底物专一性。有人提出将SPATE蛋白分成两类:一类具有细胞毒活性;另一类具有细胞外的特殊靶点,从而具备血凝素结合等特殊的生物活性。分析SPATE蛋白的氨基酸组成和排列,发现两者的载乘区域结构不同:具有血凝素结合特性的SPATE蛋白含特殊的结构域2(domain 2);而具有细胞毒性的SPATE蛋白含特殊的结构域2A(domain 2A),协助SPATE蛋白与细胞表面的受体结合[16]。

4 SPATE蛋白之间的结构差异

目前一些新发现的SPATE蛋白与传统的SPATE蛋白具有不同的特征，如新近发现的兔肠致病性大肠埃希菌SPATE蛋白在C端转运单位的铰链区不具备保守的剪切位点,这也是目前已知SPATE蛋白中唯一一个在C端没有该位点的蛋白。

在SPATE蛋白中,结构域的差异决定不同的生物学功能。生物信息学数据揭示大约有6个这样的变异区域。变化最大的区域主要存在于载乘区域右手β螺旋的回环结构中;另一个易变区域存在于载乘区域N端的一个球形域chin蛋白结合位点上,这一部分氨基酸会形成一个环-链-环的二级结构而从β螺旋主干中延伸出来，该结构在SPATE蛋白中非常普遍,其生物学功能目前尚不清楚；剩下4个变化较大的区域全部位于载乘区域β螺旋主干环内。环的位置和独特性可能与蛋白的特殊功能密切相关，使得这一家族蛋白在功能上有着各自鲜明的特点。

5 展望

SPATE蛋白是存在于很多致病性肠道杆菌中的多功能毒性相关蛋白。虽然对其中一些蛋白的功能、结构和分泌机制的研究为洞察此类蛋白奠定了一定基础,但SPATE家族蛋白中许多成员的功能和结构尚不明确,还有许多问题迄待研究,如延长的SPATE信号肽在降低蛋白从内膜向周浆间隙的转运速度中发挥怎样的作用？部分或全部折叠在周浆间隙中的SPATE多肽链与分子伴侣和DegP之间如何相互作用而促使载乘区域形成β桶状结构？SPATE蛋白的自动剪切作用如何调节？这种剪切作用是否发生在SPATE蛋白与周浆间隙的相互作用中？当载乘区域从外膜上剪切并释放后,C端转运单位的结局如何？SPATE蛋白载乘区域中哪一段残基部分与致病功能直接相关？从分子水平如何解释这些功能的多样性？

尽管大多数致病性肠道杆菌通常产生1种以上的SPATE蛋白[17],并且不断有新的SPATE蛋白亚型被发现[18],但SPATE蛋白在结构和分泌机制上具有共性。对SPATE蛋白的进一步深入研究将有助于人们设计具有针对性的共同抑制剂,从而有效降低致病菌毒力,开发具有与以往抗生素结构和作用机制完全不同的抗菌制剂。

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