ERK通路影响恶性黑色素瘤细胞周期的机制

李厚勇 周 梁 田 洁

[摘要] 目的 研究ERK信号通路对恶性黑色素瘤细胞周期的影响及其机制。方法 选用持续活化的ERK细胞株A-375,用MEK抑制剂PD98059阻断ERK信号通路,观察细胞生长曲线并用MTT法观察细胞增殖,用Western蛋白印迹法检测活化的ERK和细胞周期蛋白Cycline D1的表达,用流式细胞仪检测细胞周期。结果ERK信号通路阻断后,细胞周期蛋白Cyclin D1无表达,G0-1期细胞所占比例明显增加(P<0.01),S期细胞所占比例明显降低(P<0.01)。结论 ERK信号通路阻断后,细胞阻滞于G0-1期。其机制与细胞周期蛋白Cyclin D1的合成抑制有关。

[关键词] 恶性黑色素瘤;ERK;细胞周期;细胞周期素D1

[中图分类号] R364.7[文献标识码] A[文章编号] 1004-8650(2009)12-033-04

目前研究发现皮肤恶性黑色瘤中存在细胞外调节蛋白激酶(extra cellular regulated protein kinase ERK)的持续活化,其所占比率为78.5%(8),而ERK信号通路是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者,参与了正常细胞的增殖、转化、分化、死亡过程,其在不同细胞中的作用有所不同。在正常细胞中,其活化与细胞外信号刺激有关。那么ERK的持续活化在恶性黑色素瘤细胞起何作用,其作用机制又如何呢?本实验用ERK信号通路阻断剂PD98059阻断恶性黑色素瘤细胞株A-375中ERK的活化,观察黑色素瘤细胞增殖和细胞周期的变化,拟对上述问题进行初步研究。

1材料与方法

1.1恶性黑色素瘤细胞株A-375来源于中国科学院上海分院细胞所。

1.2试剂与仪器

1.2.1主要试剂:PD98059(Cayman 公司),以DMSO溶解,PBS稀释,兔抗人Cycline D1抗体(Cell Signaling technology 公司),DMEM培养液、胎牛血清(fetal bovine serumFBS)、胰蛋白酶(均为GIBCO公司)。Propidium iodide (PI),噻唑蓝(MTT)。

1.2.2主要仪器:COULTER Epics XL 流式细胞仪(COULTER公司),相差显微镜(Leica 公司),BIO-RAD model 680 microplate READER 酶标仪(BIO-RAD公司)。

1.2方法

细胞生长曲线:用恶性黑色素瘤细胞株A-375以6X104个细胞/孔的密度接种于24孔板,培养液为含10%FBS、青链霉素双抗的DMEM,24小时后实验组培养液换成10%FBS、50μMPD98059、青链霉素双抗的DMEM,对照组培养液不变。然后每隔24小时任意选取3孔进行细胞计数,连续6天,绘制出细胞生长曲线。

MTT检测:将A-375细胞以5X103个/孔的密度接种于96孔板,培养液为含10%FBS、青链霉素双抗的DMEM,24小时后实验组培养液改为培养液为含10%FBS、50μMPD98059、青链霉素双抗的DMEM,另设一组为空白对照组(只加培养液、MDMSO,不加细胞),每组设8个复孔。按照MTT常规方法进行实验,分别于培养后24h、48h、72h后检测各孔490nm吸光度A值。

Western蛋白印迹法检测各组细胞中磷酸化ERK酶和CyclineD1的表达:抽提培养24h各组细胞总蛋白后,进行SDS-PAGE凝胶电泳,然后用转移槽将蛋白质从凝胶上转移到硝酸纤维素膜上,用抗体耦联物进行免疫检测,用发光底物显迹。

细胞周期检测:用恶性黑色素瘤细胞株A-375以1X106个细胞/瓶的密度接种在含10%FBS、青链霉素双抗的DMEM培养瓶中,24小时后分别换成10%FBS、青链霉素双抗的DMEM,10%FBS、青链霉素双抗、50μMPD98059的DMEM。培养72小时后检测细胞周期。

流式细胞仪检测细胞周期:吸出到期培养细胞瓶中的培养液,加入0.25%的胰酶1ml,在室温下消化细胞1分钟,吸出胰酶,加入培液吹打制成细胞悬液,移入离心管,以1500rpm离心5分钟,弃上清液,加入4。C0.01MPBS,轻轻震荡使细胞悬浮,以1500rpm离心5分钟,弃上清液,重复2次,将细胞重悬于400μl DNA-PREP LPR 液中,避光室温下反应15分钟,再加入100μl PI摇匀,避光室温下反应15分钟,上机检测。

统计学处理:采用SPSS11.5软件进行统计分析。计量资料以表示,两组比较采用t检验。

2结果

MTT法显示PD98059组吸光A值明显低于10%FBS组,两组间P值分别为24h P=0.012<0.05, 48h P=0.001<0.01, 72h P=0.001<0.01见表1

Western检测结果

PD98059作用24h 细胞中无磷酸化ERK酶及细胞周期蛋白CyclineD1的表达

用t检验比较两组各期细胞差异,发现PD98059组G0-1期细胞比例明显高于对照组(p=0.001<0.01),而S期细胞比例明显低于对照组(p=0.001<0.01),G2期差异无显著性(p=0.248>0.05)(表2)。

相差显微镜观察两组细胞,发现PD98059作用72小时组的细胞较对照组稀疏,且出现凋亡(图六、图七)。

3讨论

细胞周期也称细胞分裂周期(Cell-Division Cycle),是指一个连续分裂的细胞从一次分裂完成开始,到下一次分裂完成为止所经历的全过程。可将其分为4个时期(1):G1期、S期、G2期和M期。正常细胞的生长增殖受细胞外信号的调节,许多影响细胞增殖的调控都发生在细胞周期的G1期,细胞在不适合的条件下会减慢或停止分裂,细胞周期的行进停滞在G1期,细胞进入一种静息状态,称为G0期。细胞在G0期可以长期存活而不增殖,当受到增殖信号的刺激后,G0期的细胞可以重新回到G1期。

细胞周期行进是由细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶CDKs(Cyclin-dependent kinase)触发的,CDKs通过对靶蛋白(通常是和复制、转录有关的因子)的磷酸化改变其活性,从而驱动细胞周期的运行(2)。具有细胞周期调控功能的CDKs大都是Cyclin依赖性的。Cyclin是CDKs的活化亚单位Cyclin即周期蛋白或周期素,因其表达水平在细胞周期过程中的时相性波动而得名。在细胞周期调控中较为关键的细胞周期蛋白Cyclin有A、B、D、E等。根据其含量累积达到高峰时所处的细胞周期时相不同,可以将Cyclin分为两类:G1期和M期Cyclins。前者包括Cyclin D、E,后者主要有CyclinA、B。

Cyclin D主要作用于G0/G1期转换,它是外部生长信号的主要感受器,它的转录、合成都依赖于生长信号调节。生长信号通过Ras-Raf-1-MEK-MAPKs等级联的信号转导通路的介导,传入核内,激活Cyclin D1基因的启动子,从而使Cyclin D1表达水平上升,与CDK4/6结合并激活后者的活性(3,4,5),使细胞进入分裂周期开始分裂增殖。

目前研究发现ERK酶的活性在恶性黑色素瘤中持续增高(8,9),其肿瘤的发生、发展密切相关,且Sauter等(7)等研究发现Cyclin D1 在恶性黑色素瘤细胞的增殖中起着重要作用。那么持续活化的ERK酶是否导致恶性黑色素瘤细胞Cyclin D1基因的持续表达,从而使Cyclin D1表达水平上升,促使肿瘤细胞进入细胞分裂周期,引起肿瘤细胞的异常增殖?

为研究这一问题,我们用PD98059阻断ERK信号通路并用Western蛋白印迹法检测Cyclin D1的表达,并观察恶性黑色素瘤细胞周期的变化。PD98059是MEK的阻断剂(6),可以抑制MEK的磷酸化,从而抑制ERK的磷酸化,阻断ERK信号通路,是研究ERK信号通路在细胞中作用时常用的药物。在我们的实验中可以看到,在恶性黑色素瘤细胞株A-375中,存在持续活化的ERK,且Cyclin D1 呈阳性表达,当用了该阻滞剂后,没有活化的ERK表达,ERK信号通路被阻断。从我们的实验结果可以看出ERK信号通路被阻断后,细胞周期蛋白D1呈阴性表达,肿瘤细胞增长停滞。通过对细胞周期的分析,发现ERK信号通路阻断后,G0-1期细胞比例明显上升,差异有显著性,而S期细胞明显减少,差异也有显著性,这说明ERK信号通路阻断后,对细胞周期的影响在于阻止G0-1期进入S期,而不影响已进入S期的细胞进入G2期,这样就造成了G0-1期细胞比例上升,而S期细胞比例下降。

从我们的试验结果可以看出恶性黑色素瘤中ERK酶的活性持续增高,可以导致细胞周期蛋白D1的表达,引起细胞进入分裂周期,促进肿瘤细胞增殖。 附图

参考文献

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[2] Chellappan SP,Giordano A, Fisher PB.Role of cyclin-dependent kinase and their inhibitors in cellular differentiation and development. Curr Top Microbio. Vol 227 1998:57-103

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9 Cohen C, Zavala PA,Sequeira JH,et al.Mitogen-actived protein kinase activation is an early event in melanoma progression. Clin Cancer Res.vol 8,2002:3728-3733

(收稿日期2009-10-26)