PUMA在大鼠胰腺移植缺血

曲恒怡

[摘要] 目的探讨PUMA在移植胰腺缺血再灌注损伤中的早期促凋亡作用。方法对封闭群大鼠建立大鼠腔静脉内分泌引流、肠道外分泌引流的动物模型.再灌注后第0 、1 、2 、3 、4 、6 、9 、12 h 等时点, 每时点处死5只大鼠,切取移植胰腺,石蜡包埋切片,原位DNA缺口末端标记( TUNEL) 法测定胰腺组织细胞凋亡, Western blot方法测定移植胰腺组织PUMA,bcl-2 、bax、 caspase-3蛋白表达. 结果再灌注术后第0 、1 、2 、3 、4 、6 、9 、12 h,胰腺细胞凋亡数分别为(29.42 ±4.93) 、(47.65 ±6.43) 、(74.8 ±9.73) 、(106.35 ±16.8) 、( 148.71 ±19.50) 、(123.96 ±15.54) 、( 97.32 ±10.6) 和(57.42 ±9.56)个/ 高倍视野。各时点均显著高于正常胰腺23.48 ±4.26。第4小时细胞凋亡数明显增高,12小时降低到最低值,不同组细胞凋亡数的差异有统计学意义( v=42 t=2.785P<0.01); PUMA以及其下游的 bax和caspase-8蛋白表达在第4小时达到最高峰, 12小时降低到最低值, bcl-2在第4小时达到最低值,蛋白表达差异分别有统计学意义(P<0.05), 以后逐渐升高,12小时降低到最低值, PUMA表达与各时点的细胞凋亡数有明显的正相关 ( n=5,r=1.00,p<0.05)结论I/RI后细胞早期凋亡与PUMA活化有关, PUMA是通过调节下游bax、caspase-8、bcl-2基因发挥凋亡促进作用。

[关键词] 胰腺移植; 缺血再灌注损伤;凋亡;PUMA蛋白;

[中图分类号] R364.3 [文献标识码] A[文章编号] 1004-8650(2009)12-032-02

近年来大量研究表明,细胞凋亡是器官移植缺血-再灌注损伤( ischemia-reperfusioninjury,I/RI)的早期事件[1],但细胞发生凋亡的机理不明。PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)是2001年发现的p53下游促凋亡基因,是bcl-2家族BH-3亚家族中的成员,PUMA在受到p53、缺氧、放射、化疗、等刺激信号下迅速被激活,从而导致PUMA下游bcl-2家族基因的活性改变,引起细胞色素C的释放和Caspase酶的活化,最终导致细胞凋亡[2-3]。本研究应用大鼠胰十二指肠移植模型, 探讨PUMA在大鼠胰十二指肠移植I/RI中的早期凋亡促进作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物:43只(对照组3只)清洁级封闭群SD大鼠(供体), 体质量250～ 300g ,雄性;清洁级封闭群W istar大鼠, 40只,体质量300-350g, 雄性, 均由上海实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂:鼠抗人PUMA多克隆抗体购自Cell Signals公司,兔抗鼠bcl-2 、bax、 caspase-3、Actin多克隆抗体和Western bloting试剂购自Santa Cru公司,细胞凋亡检测试剂盒购南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1 大鼠胰腺移植动物模型的制备:见文献[4]。

1.2.2移植模型的分组和处理:移植模型共分为8组,每组5只;各组大鼠于胰腺再灌注后取移植胰腺。第1-8组分别于移植后0h 、1h、 2h 、3h、 4h、6h、 9h、 12h进行,取出胰腺立即放入-800C冰箱中保存备用,其中以正常SD大鼠3只做对照。

1.3TUNEL 法显示胰腺细胞凋亡:实验方法、结果判断、数据处理参见文献[5]

1.4Western-blotting检测蛋白表达:参照《分子克隆实验指南》提取冰冻移植胰腺细胞总蛋白,测定浓度后各取100 ug蛋白,以actin为内参照,Western-blotting检测PUMA、bcl-2 、bax、 caspase-8蛋白表达。实验步骤按照说明书进行。采用北京赛智创业科技有限公司 ChampGelTM3-4进行 Western blotting图像定量分析,计算各蛋白与内参actin的比值。

1.5 统计学:数据均以均数±标准差x ±s 表示 ,用 SPSS 10.0进行统计学处理。

2结果

2.1手术时间:供体手术时间 47±2 min,袖套准备2 ±1 min, 袖套吻合2.5±1 min, 热缺血时间2 ± 3min, 受体手术时间 46±3 min,其中动脉吻合10±2 min,冷缺血时间52 ±5min,与文献[4]的结果一致.

2.2 移植胰腺细胞凋亡的检测: 再灌注术后第0 、1 、2 、3 、4 、6 、9 、12 h,胰腺细胞凋亡数分别为(29.42 ±4.93) 、(47.65 ±6.43) 、(74.8 ±9.73) 、(106.35 ±16.8) 、( 148.71 ±19.50) 、(1 23.96 ±15.54) 、( 97.32 ±10.6) 和(57.42 ±9.56)个/ 高倍视野, 正常胰腺细胞凋亡数为 23.48 ±4.26 个/高倍视野,不同组细胞凋亡数的差异有统计学意义( v=42 t=2.785P<0.01)

2.3凋亡相关基因的分析: PUMA、 bax、 caspase-8表达自1小时开始表达上调,4小时表达最多,以后表达逐渐减少,12小时表达到最低;而bcl-2 表达自1小时开始表达下调,4小时表达最少,以后表达逐渐增多,12小时达到最高,各自的表达差异分别有显著性(P<0.05)。

3讨论

实验结果显示: 细胞凋亡数自移植灌注后1小时开始明显升高,4小时达到最高,以后逐渐下降,12小时达到最低, ,这与[1,6]的研究结果基本相同,说明细胞凋亡是胰腺移植I/RI后的早期事件。

Western blot发现, PUMA在I/RI后4小时表达最明显,以后逐渐下降,12小时后降到最低水平,并且PUMA蛋白表达与细胞凋亡具有明显的正相关, 说明I/RI后早期细胞凋亡与PUMA高度活化有关.与此同时,PUMA下游bax、 caspase-8促凋亡蛋白也遵循PUMA的表达变化,而PUMA下游的bcl-2抑凋亡蛋白与PUMA的表达规律相反,说明PUMA是通过调节下游的bax、caspase-8、bcl-2基因发挥凋亡促进作用的.我们的实验提示,抑制PUMA基因活化可能有助于预防I/RI后早期细胞凋亡.该研究为以后的I/RI的防治提供理论依据.

参考文献:

[1] Zhaohui Z, Xi L , Kuiyang L. Apoptosis induced by cold ischemia and Reperfusion after pancreas transplantationin rats. J Digestive Surg ,2004,3:278-281.

[2] Yu, L. Zhang, P.M. Hwang, K.W.et al.PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells[J]. Mol. Cell; 2001,12(7): 673–682.

[3] Nakano, K.H. Vousden. PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53[J].Mol. Cell ,2001,12(7): 683–694.

[4] 朱兴国,陈彦,李德春,等.大鼠胰十二指肠移植动物模型的制作[J].中华实验外科杂志,2005 ,22 (4 ):496-497

[5] 李占京,韩本立,吴军,胰腺移植急性排斥反应中的细胞凋亡[J].中华实验外科杂志,2000;17 (4):335-336

[6] Drognitz O , von Dobschuetz E , Kisslerb H , et al . Organ procurement in experimental pancreas transplantation with minimal microcirculatory impairment[J] . Eur Surg Res , 2004 , 36 :185219

(收稿日期2009-10-18)