利用人源化小鼠研究组织工程材料的体内免疫原性

张秋玉 盛慧明 崔磊 王瑛 尹烁 林锦骠 吴娟娟 沈佰华 王利 李宁丽

利用人源化小鼠研究组织工程材料的体内免疫原性

张秋玉 盛慧明 崔磊 王瑛 尹烁 林锦骠 吴娟娟 沈佰华 王利 李宁丽

目的建立并利用人源化小鼠模型，研究组织工程材料的体内免疫原性。方法利用NOD/SCID小鼠（非肥胖型糖尿病鼠与重症联合免疫缺陷鼠反交鼠模型），通过腹腔注射人外周血单个核细胞（PBMC）（100×106）建立人源化小鼠，在人源化小鼠皮下植入异体人皮肤（阳性对照）、人体脂肪干细胞与脱钙骨构建的组织工程骨（实验组）、单纯脱钙骨材料（阴性对照）。在植入后1周、2周、3周、4周，取小鼠尾静脉血，流式细胞仪检测人CD4+和CD8+淋巴细胞比例。4周后，取小鼠的移植局部皮肤进行HE染色分析，同时检测脾细胞人CD4+和CD8+淋巴细胞比例。结果NOD/SCID小鼠腹腔注射人PBMC 4周内，在外周血和脾中均可测到人CD4+和CD8+淋巴细胞。病理分析结果显示：在人源化小鼠皮下植入的组织工程材料及成体干细胞构建的组织工程骨组未见炎性细胞浸润；而单独植入人皮肤组可见明显的炎性细胞浸润。结论人源化小鼠可作为组织工程材料体内免疫原性的研究的良好模型。

非肥胖型糖尿病鼠与重症联合免疫缺陷鼠反交鼠模型小鼠免疫原性组织工程材料

再生医学与组织工程尝试用干细胞构建修复缺损病变的组织与器官，需要充沛、稳定、安全的种子细胞来源。成体干细胞作为一种新的干细胞来源，具有弱免疫原性以及负性免疫调节作用的特性[1，2]。目前，关于人的异体干细胞免疫原性的体内研究报道较少，体内实验对于判断异体干细胞组织材料是否具有免疫原性极为重要。随着NOD/SCID小鼠的培育成功，为建立人源化动物模型及在体研究异体干细胞免疫原性提供了可能[3-6]。脂肪源干细胞（Adiposederived stem cells，ADSCs）是来源于脂肪组织的一类具有自我更新和多向分化能力的成体干细胞[7]，与其他的成体干细胞一样，ADSCs也具有免疫负调节功能[8-9]。关于人源化NOD/SCID小鼠用于研究干细胞及组织工程材料的体内免疫原性尚无报道。

本研究在建立了人源化NOD/SCID小鼠基础上，用该模型进行体内（皮下）移植人皮肤、组织工程材料及覆盖异体脂肪干细胞的组织工程材料，通过在接种后不同时间用流式细胞仪检测受体小鼠的T细胞及其亚群格局及移植部位的淋巴细胞浸润程度，分析该小鼠作为在体研究异体干细胞免疫原性模型和异体脂肪干细胞覆盖的人工材料所具有的免疫原性，为进一步研究开发新型组织工程材料和异体脂肪干细胞用于临床植入修复提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物、细胞

NOD/SCID小鼠，6周龄，雌性，购自中国军事医学科学院动物中心，饲养于上海交通大学医学院实验动物中心SPF实验室独立送风柜中；人外周血取自上海市血液中心；异体人皮片、异体干细胞覆盖的硅胶及单纯组织工程材料（硅胶）由上海市组织工程研究重点实验室提供。

1.1.2 试剂和仪器

RPMI 1640培养液、血清及细胞培养液添加剂（Hyclone公司），96孔培养板（BD公司），FACS（BD Calibur公司），离心机（Sigma公司），淋巴细胞分离液Ficoll（密度1.077，上海试剂二厂），人APC-CD3、FITC-CD4、PE-CD8标记抗体（BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 人外周血单个核细胞（PBMC）的分离

用生理盐水将外周血按1∶2稀释，小心叠加淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心20 min，用毛细滴管小心吸取上、中层界面处白色云雾状的细胞层，用生理盐水洗涤2次并计数。

1.2.2 人源化NOD/SCID小鼠的建立及鉴定

选择6周龄、体型均一、毛色光亮的雌性NOD/ SCID小鼠，腹腔注射PBMC 100×106；分别于注射后1周、2周、3周、4周取尾静脉血，通过红细胞裂解液直接裂解红细胞的方法分离白细胞，流式细胞仪检测人CD4+、CD8+淋巴细胞百分率；4周后处死小鼠，分离脾细胞，检测脾细胞中人CD4+、CD8+淋巴细胞百分率。

1.2.3 实验分组与处理

在NOD/SCID小鼠腹腔注射PBMC次日，2%戊巴比妥麻醉模型鼠，无菌手术钝性分离小鼠背部皮肤，分别对称植入同种异体人皮肤（阳性对照），覆盖异体脂肪干细胞[7-8]的脱钙骨材料（实验组），单纯脱钙骨材料（阴性对照）。小心缝合伤口。

1.2.4 取样及检测

在皮下接种后1周、2周、3周、4周后，分别取移植部位的皮肤，以4%多聚甲醛固定，常规HE染色分析；在每周取材的同时，流式细胞仪检测人CD4+、CD8+、CD3+淋巴细胞百分率。最后一次取材时，处死人源化NOD/SCID小鼠，检测小鼠脾细胞中人CD4+、CD8+淋巴细胞百分率。

1.3 统计学分析

本实验数据采用SPSS软件分析。两样本均数的比较采用t检验，P＜0.05有显著性差异。

2 结果

2.1 NOD/SCID小鼠体液免疫和细胞免疫缺陷的验证

为了保证人源重建鼠模型的成功构建，我们首先比较了野生型C57BL/6J小鼠（Wild type，WT）和NOD/SCID小鼠血清IgG水平以及脾细胞中CD4+及CD8+淋巴细胞的百分率。结果表明：NOD/SCID小鼠外周IgG（OD＝0.25）明显低于野生型C57BL/6J小鼠血清IgG（OD＝1.00），两者IgG水平有显著性差异（P＝0.0036）（图1A）。外周血T细胞及其亚群格局检测结果显示：C57BL/6J小鼠CD3+CD8+、CD3+CD4+所占比例分别为19.53%和42.09%，而NOD/SCID鼠CD3+CD4+、CD3+CD8+所占比例分别为1.95%和0.81% (图1B)。以上结果证明该鼠免疫系统是完全缺陷的。

2.2 人源化小鼠的体内人淋巴细胞的动态变化

在人源化小鼠建模1周、2周、3周、4周后，取外周血检测其T细胞比例。结果表明：模型鼠外周血中人T细胞的含量随着时间的推移而逐渐降低，4周后降至检测下限（图2A）。此外，在建模4周后，在脾细胞中仍能测到人CD4+及CD8+细胞（图2B）。以上结果提示，腹腔注射的人PBMC，可进入NOD/ SCID小鼠的外周血和外周免疫器官，并能维持至少4周以上，提示人源小鼠模型构建成功。

2.3 人源化小鼠移接受移植物后体内人PBMC的动态变化

在人源化小鼠模型植入同种异体人皮片后，同上法观察模型鼠的外周血人淋巴细胞比例。结果发现，模型鼠在接受移植物后，外周血中人T细胞比例较上述未接受移植物的空白模型组明显降低，4周后几乎无法测及。然而在脾细胞中，注射人PBMC 4周后，仍可测到少量的T细胞，所占比例较空白模型组有所降低，并有一定的个体差异（图3）。结果提示，人PBMC细胞在接受移植物的人源化小鼠中，并非停留在外周血循环中，而主要通过循环到达移植部位发挥效应。

2.4 植入材料在不同时间点的淋巴细胞浸润格局

在人源化小鼠皮下植入各种材料的1周及4周后，分别取出移植部位的皮肤进行HE染色分析其淋巴细胞浸润程度。结果发现：人皮肤移植在移植后1周，于真皮下层组织即可见明显的淋巴细胞浸润，4周时更加明显（图4A）；而覆有干细胞的组织材料组不论在移植后的第1周还是第4周均未见淋巴细胞浸润（图4B），与阴性对照（单纯硅胶材料移植组相似）（图4C）。提示：异体来源组织确能激发NOD/SCID的人源化小鼠产生免疫应答，表现为移植物部位有大量淋巴细胞浸润；而覆有干细胞的组织材料植入人源化小鼠后，未发现有淋巴细胞的浸润，与单纯硅胶材料移植组相似，提示异体干细胞并未在体内诱导免疫应答，与之前所报道的干细胞具有免疫负调节特性吻合[9]，同时也提示，该小鼠模型具有检测干细胞材料的免疫原性应用潜能。

图1 NOD/SCID小鼠体液及细胞免疫水平检测

图2 人源化小鼠外周血及脾细胞中人CD4+及CD8+细胞比例

图3 接受移植物的人源化小鼠外周血及脾细胞中人CD4+及CD8+细胞的百分率

图4 人源化NOD/SCID小鼠植入各种材料后的淋巴细胞浸润情况

3 讨论

免疫原性是限制异体移植和种子库的关键，利用构建的人源化小鼠可以在体内观察研究移植物包括目前干细胞构建的组织工程材料的免疫原性的动态变化过程。SCID(Severe Combined Immune-Deficiency)小鼠是首先由Bosma等人在C.B-17小鼠发现，因其B细胞与T细胞严重的免疫缺陷，无法排斥移植的人淋巴细胞，为人源化小鼠的构建提供可能。但SCID小鼠在生长发育过程中存在渗漏现象，即其免疫系统的功能可部分恢复。利用和NOD（Non obesity diabetes）鼠反交的方式获得的NOD/SCID小鼠可减少渗漏现象[10-13]，它相对于仅T细胞功能缺陷裸鼠而言具有更加完整的免疫缺陷。因此我们选用NOD/SCID小鼠作为构建人源化小鼠模型的受体鼠，通过比较其与野生型C57BL/6J小鼠血清IgG水平及外周血淋巴细胞比例，提示NOD/ SCID小鼠细胞及体液免疫均处于缺陷状态，无明显渗漏现象。

构建人源化小鼠的方法较多，其中人外周血单个核细胞移植方法简单易行，本研究采用该方法建立人源化小鼠。人源化小鼠体内人淋巴细胞的存活时间以及是否能有效发挥免疫应答功能是免疫重建的关键。已有文献报道，人PBMC在重建人源化小鼠外周血中存在8周左右[14]。本研究的结果提示，在单纯建模的人源化小鼠体内，人的PBMC可存在4周左右，可能是因为人PBMC接种数量以及个体差异所致[5]。本研究也发现，随着时间的延长，模型鼠体内人PBMC的数量不断减少，其中以外周血衰减尤为明显。在建模4周后脾细胞中仍能测及人PBMC，这一现象提示腹腔注射的人PBMC可以迁移至外周血并在次级淋巴器官如脾等部位定居，为识别外来抗原和激发免疫应答提供可能。

在成功构建人源化NOD/SCID小鼠后，我们通过皮下种植各种组织材料，观察其体内的免疫原性。研究结果首先发现，在人源化小鼠模型植入人皮肤后，其外周血中人淋巴细胞比例的减少速度较未接受移植物的模型组更快，且脾中人淋巴细胞比例也明显降低。该结果提示：植入的人异体皮片能诱导人源化小鼠产生有效的免疫应答，通过动员外周血中的淋巴细胞，使之趋化到局部并参与免疫反应，从而表现为外周血及外周淋巴器官中人PBMC数量的快速衰减。同时，我们通过HE染色分析了不同材料移植组小鼠的皮肤切片，结果表明：阳性对照组的皮肤真皮组织中有大量淋巴细胞浸润，而实验组和阴性对照组未见炎性细胞浸润。说明人源化小鼠体内的人淋巴细胞能够有效识别异己抗原并行使免疫清除的功能，证实本研究建立的人源化小鼠可以模拟人体内的细胞免疫，观察移植物的免疫原性。单独硅胶移植组，因所采用的空材料支架免疫原性低下，人源鼠对其不识别，不激发免疫应答，未见淋巴细胞的浸润。ADSCs与其他的成体干细胞一样也具有免疫负调节功能[7-9]，而且脂肪干细胞来源容易、扩增量大，已经提示这是一种极有应用潜能的成体干细胞。本研究结果表明，人源化小鼠的人淋巴细胞不识别异体脂肪干细胞覆盖的组织材料，说明异体脂肪干细胞作为种子细胞的组织工程材料仍然保持了成体干细胞的低免疫原性，极有可能成为潜在的组织工程种子细胞。

总之，本研究成功构建了人源化NOD/SCID小鼠模型，通过观察模型鼠外周血人淋巴细胞比例的动态变化及移植局部的病理切片，表明该小鼠可作为在体研究异体干细胞免疫原性的动物模型。同时，本研究还提示：异体脂肪干细胞覆盖的人工材料仍与无细胞的材料一样具有低免疫原性，为进一步的临床应用提高了实验依据。

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Experimental Study of Immunogenicity of Tissue Engineering Materials by Using Humanized NOD/SCID Mice

ZHANG Qiuyu1,2,SHENG Huiming1,CUI Lei3,WANG Ying1,YING Shuo3,LIN Jinbiao1,WU Juanjuan1,SHEN Baihua1, WANG Li1,LI Ningli1.
1 Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Institute of Immunology,Shanghai 200025,China.2 Department of Immunology,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China.3 Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center,Shanghai 200235,China.Corresponding author:LI Ningli.

ObjectiveTo investigate the immunogenicity of new transplanted materials in vivo by using humanized NOD/SCID mice model.Methodshumanized mice model was established by transferred 100×106human peripheral blood mononuclear cells(PBMC)into NOD/SCID mice.Next day,the mice were received the allotransplantation of pieces of human skin from plastic surgery patients as positive control group and received tissue engineering materials(silica gel) accompanying with human adipose-derived stem cells(ADSCs)as experimental group.Negative control group was transplanted with silica gel alone.The percentage of human CD4+and CD8+T cells in peripheral blood and spleen was detected by fluo-rescent flow cytometry(FACS)at 1,2,3 and 4 weeks after operation.Human lymphocytes infiltration within the engrafted section was examined by hematoxylin-eosin staining 4 weeks after transplantation.ResultsHuman CD4+and CD8+T cells have been detected both in peripheral blood and spleen of humanized NOD/SCID mice.The percentage of human CD4+and CD8+T cells in peripheral blood decreased gradually.However,in the mice received the grafts,the percentage of human PBMC decreased much faster.The hematoxylin-eosin staining showed that in the experimental group, wound inflammatory response was slight,without lymphocytes infiltration.In contrast,all human skin grafts were rejected 4 weeks after subcutaneou transplantation.ConclusionThese results indicated that the humanized NOD/SCID mice model could be used to analyze the immunogenicity of new transplnted tissue material in vivo.

NOD/SCID mice;Immunogenicity;Tissue engineering material

R392.12

A

1673－0364（2009）04－0190－05

2009年4月16日；

2009年6月4日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.08.003

350004福建省福州市福建医科大学免疫系（张秋玉）；200025上海市上海交通大学医学院，上海市免疫学研究所（张秋玉，王瑛，盛慧明，林锦骠，吴娟娟，沈佰华，王利，李宁丽）；200235上海市上海组织工程研究与开发中心（崔磊，尹烁）。

李宁丽。