4种绣球花粉离体萌发研究

摘 要 通过探究‘棉花糖’、‘精灵’‘银边绣球’和蜡莲绣球花粉离体萌发和花粉贮藏条件，为绣球杂交育种等研究工作提供参考。采用单因素试验和正交试验研究蔗糖、硼酸和氯化钙浓度对4种绣球花粉离体萌发的影响，在此基础上进一步探讨光照度、萌发温度、贮藏温度对绣球花粉萌发的影响。结果表明，在单因素试验中，蔗糖和硼酸在一定浓度范围内对4种绣球花粉萌发起促进作用，超过一定浓度则抑制萌发；适量的氯化钙对‘精灵’花粉离体萌发有促进作用，对‘棉花糖’、银边绣球和蜡莲绣球花粉离体萌发均有一定程度的抑制作用。正交试验中，适合‘棉花糖’和银边绣球花粉萌发的最佳培养基均为A2B3C1，即蔗糖100 g/L+硼酸300 mg/L+氯化钙15 mg/L，萌发率分别为32.65%和35.07%；‘精灵’花粉萌发的最佳培养基为A3B2C1，即蔗糖150 g/L+硼酸150 mg/L+氯化钙15 mg/L，萌发率为83.59%；蜡莲绣球的最佳培养基为A1B1C1，即蔗糖30 g/L+硼酸30 mg/L+氯化钙15 mg/L，萌发率为21.38%。4种绣球花粉萌发最佳光照度为200 lx，最适温度为25 ℃和30 ℃；‘棉花糖’、‘精灵’和银边绣球花粉中短期贮藏的适宜温度为-80 ℃，蜡莲绣球花粉贮藏的适宜温度为-20 ℃。

关键词 绣球花粉；离体萌发；正交试验；贮藏温度；光照度

绣球（Hydrangea macrophylla）又名八仙花、粉团花、紫阳花，是绣球科绣球属植物，原产于中国和日本。绣球园艺品种繁多，花色艳丽，花序硕大，花期长，可作观赏灌木、鲜切花和盆栽花卉，具有极高的观赏价值。我国应用的绣球品种主要是从欧洲等国家进口［1-2］。我国野生绣球资源丰富，是绣球属植物资源的中心，但是国内绣球属植物育种研究相对落后，野生资源开发利用不足［3-4］。

杂交育种是绣球新品种选育的重要途径，而花粉活力是影响杂交育种的重要因素［5-6］。因此，在进行杂交前明确花粉活力，可以在一定程度上规避杂交风险，提高育种效率［7］。花粉活力测定方法有TTC染色法、I2-KI染色法、孢粉染色法和离体萌发法等［8］。花粉离体萌发法是模拟花粉在柱头上的自然萌发状态，可以更接近真实地反映花粉在植物体内的萌发率［9-11］。花粉离体萌发率取决于花粉本身的活力和花粉萌发条件两个因素［12］。不同植物花粉萌发时对营养成分的需求不同。韩勇等［13］对‘爱莎’等大花绣球花粉进行了离体萌发试验，筛选出所试品种最适培养基为“蔗糖10%+硼酸50 mg/L+氯化钙30 mg/L”。绣球园艺品种和国内丰富的野生种杂交可以选育具有自主知识产权的兼观赏性和适应性的优良品种，但是大多数园艺品种和野生种存在花期不遇，所以花粉的管理也尤为重要。花粉管理包括采集时间和储存等［14］。目前关于绣球花粉的研究多集中在花粉粒形态特征方面［15-18］，关于野生绣球和园艺品种花粉活力的报道较少。本试验选择园艺绣球品种‘棉花糖’、‘精灵’、银边绣球和秦岭的蜡莲绣球，采用花粉离体萌发法，筛选最佳蔗糖、硼酸和氯化钙组合作为萌发基质，研究温度、光照度、萌发时间和贮藏温度对绣球花粉萌发率" 的影响，为绣球杂交育种工作的开展提供参考" 依据。

1 材料与方法

1.1 花粉的采集与处理

‘棉花糖’‘精灵’‘银边绣球’和蜡莲绣球均种植在陕西省西安植物园（陕西省植物研究所），于5月盛花期采集‘棉花糖’‘精灵’‘银边绣球’花粉，6月盛花期采集蜡莲绣球花粉。均选取生长健壮、无病虫害绣球植株，于9：00-10：00取当日散粉的花朵，用硫酸纸包裹带回实验室，收集花粉，进行离体萌发试验，同时，用于后续试验的花粉用硫酸纸包裹后立即放入干燥剂中，分别置于常温25 ℃、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃保存。

1.2 方" 法

1.2.1 离体萌发法测定花粉活力 配制所需蔗糖、硼酸、氯化钙质量浓度的培养基，滴1滴于载玻片上，用棉签蘸取花粉后轻弹撒于培养液上，每种花粉3个重复。将载玻片放在有湿润滤纸的培养皿中，盖上盖子，在光照培养箱中培养后，在显微镜下观察萌发情况。统计萌发率时随机选取不少于50粒花粉的5个视野，花粉管长度超过花粉粒直径的计为萌发，计算花粉萌发率，取平均值。花粉萌发率（%）=萌发的花粉数/视野内花粉粒总数×100%。

1.2.2 培养基的单因素试验 参照韩勇等［13］关于大花绣球花粉萌发试验的方法，分别对蔗糖、硼酸、氯化钙进行单因素试验（表1）。通过萌发率统计结果确定3种成分的浓度用于下一步正交" 试验。

1.2.3 培养基的正交试验 在单因素试验的基础上，为探索绣球花粉离体萌发的最佳培养基配方，采用L9（34）正交设计，研究培养基组分中蔗糖（A）、硼酸（B）、氯化钙（C） 3个因素的各个水平对绣球花粉离体萌发的影响，因素水平见表2。

1.2.4 不同光照度对绣球花粉离体萌发率的影响 利用筛选出的最优培养基，在25 ℃下，将绣球花粉分别置于0、50、200、500、" 1 000、2 000、" 3 000、4 000 lx光照度下离体萌发16 h，统计绣球花粉萌发率，筛选出最佳光照度。

1.2.5 不同温度下萌发时间对绣球花粉离体萌发率的影响 利用筛选出的最优培养基及最佳光照度，研究绣球花粉在20、25、30 ℃下萌发时间为1.5、3、5、8、12、16、24 h的离体萌发率。

1.2.6 贮藏温度对绣球花粉萌发率的影响 在筛选出的最优培养基、最佳光照度及适宜萌发温度下，对在25、4、-20、-80 ℃贮藏0 （对照CK）、20、40、60、80、100 d的绣球花粉进行离体萌发，统计萌发率。

1.3 数据处理

采用Excel 2010软件绘制图表，采用SPSS19.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素对绣球花粉萌发率的影响

通过对蔗糖、硼酸、氯化钙的单因素试验，结果表明，3个单因素对不同绣球花粉离体萌发的影响不同（图1）。蔗糖对4种绣球花粉萌发作用显著，变化趋势整体均呈倒“V”型，当蔗糖质量浓度为100 g/L时，‘棉花糖’和‘精灵’花粉萌发率最大，分别为25.73%和42.33%；蔗糖质量浓度为30 g/L时，‘银边绣球’和蜡莲绣球花粉萌发率最大，分别为26.52%和14.35%。硼酸对4种绣球花粉离体萌发的作用不尽相同，‘棉花糖’‘精灵’和‘银边绣球’的萌发曲线均为双峰型，‘棉花糖’花粉萌发的两个最大峰值分别出现在硼酸质量浓度为30 mg/L和150 mg/L，‘精灵’的两个峰值分别出现在硼酸质量浓度为150 mg/L和300 mg/L，‘银边绣球’的两个峰值分别出现在30 mg/L和300 mg/L；不同硼酸质量浓度下蜡莲绣球花粉萌发率均较低，≤2.02%（文中未显示蜡莲绣球数据）。适量的氯化钙对‘精灵’花粉离体萌发有一定的促进作用，不添加氯化钙时萌发率为0，随着Ca2+质量浓度增大花粉萌发率显著提高，质量浓度为30 mg/L时萌发率最大，为2.38%，当质量浓度增加到300 mg/L时萌发率降为0；单独添加氯化钙对‘棉花糖’‘银边绣球’和蜡莲绣球花粉离体萌发均有一定程度的抑制作用，且萌发率均较低（文中未显示数据）。通过单因素试验对4种绣球花粉离体萌发率影响的综合分析，确定表2中的因素水平进行正交试验。

2.2 正交试验对4种绣球花粉萌发的影响

在单因素试验基础上，为寻求蔗糖、硼酸、氯化钙的最佳组合，从中选取适宜的质量浓度梯度设计三因素三水平L9（34）正交试验（表3）。结果显示，4种绣球在不同培养基上的花粉萌发率具有显著差异。其中，‘棉花糖’在组合6（A2B3C1）上的萌发率最高为32.65%，最低组合2（A1B2C2）为13.13%，相差19.52%；‘精灵’在组合8（A3B2C1）上的萌发率最高为83.59%，最低组合2（A1B2C2）为38.76%，相差44.83%；‘银边绣球’在组合6（A2B3C1）上的萌发率最高为" 35.07%，最低组合9（A3B3C2）为18.14%，相差" 16.93%；蜡莲绣球在组合1（A1B1C1）上的萌发率最高为21.38%，最低组合7（A3B1C3）为" 5.00%，相差16.38%。4种绣球花粉离体萌发率由大到小依次为‘精灵’＞‘银边绣球’＞‘棉花糖’＞蜡莲绣球，最优培养分别为A3B2C1 、A2B3C1 、A2B3C1 、A1B1C1。

各因素在不同水平上的平均值（Ki）及极差（R）分别反映了不同因素各水平对绣球花粉萌发率的影响情况及该因素对绣球花粉萌发率的影响程度，Ki值越大，萌发率越高，R值越大，该因素影响越大［19］。由直观分析可知，在‘棉花糖’花粉萌发中，蔗糖（A）、硼酸（B）、氯化钙（C）3个因素的Ki最大值分别为K2、K3、K1，3个因素对花粉萌发率影响的R值大小依次为蔗糖（A）＞氯化钙（C）＞硼酸（B）；‘精灵’花粉萌发中3个因素的Ki最大值分别为K3、K2、K1，R值大小依次为蔗糖（A）＞硼酸（B）＞氯化钙（C）；银边绣球花粉萌发中3个因素的Ki最大值分别为K2、K3、K1，R值大小依次为氯化钙（C）＞蔗糖（A）＞硼酸（B）；蜡莲绣球花粉萌发中3个因素的Ki最大值均为K1，R值大小依次为蔗糖（A）＞氯化钙（C）＞硼酸（B）。直观分析结果可看出，影响花粉萌发3因素Ki最大值组合与表3中各绣球花粉萌发率最大值一致；‘棉花糖’‘精灵’和蜡莲绣球花粉萌发率影响最大的因素为蔗糖，‘银边绣球’影响最大的因素为氯化钙。方差分析结果表明，蔗糖对‘精灵’花粉萌发率达到显著影响，是‘精灵’花粉萌发最关键因素，其他因素影响均不显著；3因素对‘棉花糖’‘银边绣球’和蜡莲绣球影响均不显著。

2.3 光照度对4种绣球花粉萌发的影响

在25 ℃条件下，分别在最优培养基上进行光照度对花粉萌发率影响试验。从图2可以看出，光照度对4种绣球花粉离体萌发率有显著影响。4种绣球花粉萌发率最大光照度均为200 lx。在0 lx（黑暗）和50 lx光照条件下，‘棉花糖’‘精灵’和‘银边绣球’花粉萌发率均显著高于500 lx及更强光照下的萌发率，且随着光照度增大花粉萌发率显著降低，当光照度为4 000 lx时，较最大萌发率分别降低28.35%、64.55%和24.89%。蜡莲绣球在0 lx（黑暗）和50 lx光照度与较高光照度下花粉萌发率差异不显著。可见，4种绣球花粉萌发均在弱光照条件下进行。

2.4 不同温度下培养时间对绣球花粉离体萌发率的影响

花粉萌发是花粉细胞内一系列生化反应的结果，温度是影响生化反应进行的基本条件之一［20］。选择最优培养基及200 lx光照度，分别在20 ℃、25 ℃、30 ℃下观察4种绣球花粉离体萌发情况，结果见图3。由图3可知，4种绣球花粉均在20 ℃时萌发速率和萌发率最低，‘棉花糖’‘银边绣球’和蜡莲绣球均在培养时间为16 h时达到最大萌发率，‘精灵’在24 h 达到最大萌发率。‘棉花糖’花粉在25 ℃和30 ℃下培养时间为16 h时达到最大萌发率，且差异不显著；‘精灵’‘银边绣球’和蜡莲绣球花粉在25 ℃和30 ℃下均分别在16 h和12 h达到最大萌发率，且两个温度下的最大萌发率均差异不显著。综上分析可知，" 25 ℃和30 ℃均为4种绣球花粉适宜萌发温度，温度过低不利于花粉萌发。

2.5 贮藏温度对4种绣球花粉萌发率的影响

图4显示，随着贮藏时间的延长，4种绣球花粉萌发率均逐渐降低，且总体趋势为先快后慢。在室温25 ℃条件下，4种绣球花粉萌发率均急速下降，第20天时，‘棉花糖’‘精灵’‘银边绣球’和蜡莲绣球花粉萌发率分别降低到3.29%、" 11.75%、5.24%和7.49%；当贮藏时间为60 d时，萌发率均为0，这可能是由于较高温度下花粉呼吸作用强，营养消耗多，导致花粉活力迅速下降。随着贮藏温度降低，‘棉花糖’‘精灵’和‘银边绣球’花粉萌发率均逐渐增加，而蜡莲绣球是在" -20 ℃贮藏时萌发率最高。绣球花粉在各低温贮藏下萌发率降低差异显著，‘棉花糖’花粉在贮藏100 d时，-80 ℃、-20 ℃和4 ℃条件下萌发率分别降低到对照（CK）的22.37%、16.97%和" 8.70%，‘精灵’花粉萌发率分别降低到对照（CK）的29.82%、20.91%和4.06%，蜡莲绣球分别为对照（CK）的37.71%、43.30%和2.35%。‘银边绣球’花粉在-80 ℃条件下贮藏100 d萌发率降低到对照（CK）的51.13%，且与贮藏80 d差异不显著，-20 ℃和4 ℃条件下萌发率分别降低到对照（CK）的22.29%和9.39%。综上可知，" -80 ℃适合‘棉花糖’‘精灵’和‘银边绣球’花粉的中短期贮藏，且‘银边绣球’花粉萌发率下降最慢；-20 ℃更适合蜡莲绣球花粉的贮藏。

3 结论与讨论

花粉萌发率是衡量花粉活力的主要标志，花粉萌发受自身发育状况、培养基组分、光照、温度、储存条件等环境因子的影响［21］。花粉离体萌发一般是在培养基上进行，蔗糖是培养基的主要成分之一，既是花粉粒萌发及花粉管壁合成的主要营养物质，又是花粉代谢的重要碳源及细胞的渗透调节物质［22］。蔗糖质量浓度过高过低都会影响花粉萌发，必须控制在合理范围内。冯建文等［23］研究表明，‘嘎啦’苹果花粉萌发率随着蔗糖质量浓度加大而逐渐增加，当蔗糖为80 g/L时萌发率最大，当蔗糖的添加量继续增大时，花粉萌发率呈下降趋势。本研究中，‘棉花糖’‘精灵’‘银边绣球’和蜡莲绣球分别在蔗糖质量浓度为100"" g/L、100 g/L、30 g/L、30 g/L时花粉萌发率最大，依次为25.73%、42.33%、26.52%、14.35%，随着蔗糖质量浓度增大，萌发率均降低，与上述研究结果一致。硼酸的作用主要是硼离子能与蔗糖形成络合物，易于通过质膜，促进糖的吸收与代谢［24］。本研究结果表明，硼酸对‘棉花糖’‘精灵’‘银边绣球’和蜡莲绣球花粉萌发均有不同程度的促进作用，且硼酸质量浓度过高或者过低均会抑制花粉萌发。Wang等［25］认为，适宜质量浓度的外源Ca2+能够促进花粉离体萌发。本研究中，Ca2+为‘精灵’花粉萌发的必须因素，适宜质量浓度的氯化钙对‘精灵’花粉萌发有显著的促进作用，质量浓度为30 mg/L时萌发率最大，300"" mg/L时萌发率为0。杨界等［26］发现Ca2+抑制狭叶重楼花粉的萌发。郭丽等［27］研究表明，Ca2+对大岩桐花粉萌发虽不具备促进作用，但对花粉管的生长具有显著的促进作用。本研究的单因素试验中，氯化钙对‘棉花糖’‘银边绣球’和蜡莲绣球花粉萌率发均有一定程度的抑制作用，但在正交试验中与蔗糖、硼酸的最佳组合，对萌发率有一定的促进作用，原因可能是3因素之间的协同作用，具体机制有待进一步研究。

光照对植物花粉萌发的影响因植物种类而不同。张忠镇等［28］研究发现，1 600～2 000 lx是元宝枫花粉萌发的最佳光照度，低于800 lx不利于花粉萌发；彭向永等［29］也发现，增加光照度可以提高蒿柳花粉萌发率，低于1 200 lx不利于花粉萌发。与以上结果不同，西番莲花粉在0 lx（黑暗）条件下的离体萌发率最高，花粉管生长最佳［30］；遮阳不仅有利于延长猪牙花花粉活力保持时间，还能增强花粉活力［31］。本研究发现，4种绣球均在0 lx（黑暗）或弱光环境下花粉萌发率较高，光照度为200 lx时萌发率最高，随着光照度增加萌发率逐渐降低，这可能是由于绣球自身特性以及生长环境导致的。

花粉贮藏是植物种质资源保存和花期不遇品种进行杂交工作的关键，有效的花粉贮藏方法是保育工作顺利进行的重要基础［32］。花粉在贮藏期间持续地进行呼吸等代谢活动，不间断地消耗着自身营养物质，导致花粉生活力下降直至丧失，而贮藏温度是影响花粉活力保持物质降解或者转化速度的最主要因素之一［33］。对大多数植物而言，贮藏温度越低，花粉寿命越长；贮藏时间越长，花粉生活力越低。赵萍等［34］试验结果表明，与" 4 ℃和-20 ℃相比，-80 ℃储存190 d的紫斑牡丹花粉仍有较高活性和萌发率，适用于花粉的长期保存。本研究中，‘棉花糖’‘精灵’和‘银边绣球’花粉在-80 ℃中短期贮藏优于25 ℃、4 ℃和-20 ℃，与上述研究结果基本一致。Kumari等［35］发现-20 ℃比-80 ℃更适宜罗勒属植物花粉贮藏。蜡莲绣球花粉贮藏的各个阶段，-20 ℃条件下的花粉萌发率均高于-80 ℃，这可能一方面是由于在超低温条件下，蜡莲绣球中的保护酶受低温刺激活性迅速下降，对花粉内部清除活性氧的能力减弱，导致花粉极易衰老与死亡；另一方面可能由于蜡莲绣球花粉湿度过高，花粉细胞结冰导致细胞膜受损［36］。绣球花粉贮藏过程中花粉湿度对萌发率的影响有待进一步研究。适宜的花粉贮藏方式和条件可以为绣球育种工作的顺利进行提供技术保障。

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Pollen Germination in vitro of Four Hydrangea Species

LIU Guoyu1，2， WANG Qing1，2， ZHANG Wenbo3，

LIU Ancheng1，2，ZHAO Xueyan1，2 and" LI Yan1，2

（1. Xi’an Botanical Garden of Shaanxi Province （Institute of Botany of Shaanxi Province）， Xi’an 710061， China;

2. Shaanxi Engineering Research Centre for Conservation and Utilization of Botanical Resources， Xi’an

710061， China; 3. Xi’an Agricultural" Technology Extension Center， Xi’an 710061，China）

Abstract In order to serve as a reference for Hydrangea crossbreeding studies， we conducted a study on the in vitro germination and storage conditions of pollen from four varieties：Hydrangea macrophylla ‘Cotton Candy’， Hydrangea macrophylla ‘Pillnitz’， Hydrangea macrophylla ‘Tricolor’ and Hydrangea strigosa.We investigated the effects of factors including sucrose， boric acid and calcium chloride concentration， on in vitro pollen germinationof four Hydrangea species using single factor and orthogonal design. Additionally， we investigated the effects of other factors including light intensity and temperature during germination and， storage temperature of pollen， on pollen germination of Hydrangea.The results showed that appropriate concentration of sucrose and boric acid promoted the pollen germination of four Hydrangea species.However， the pollen germination was inhibited in case of the concentration beyond the appropriate values. The appropriate amount of calcium chloride promoted the pollen in vitro germinations of Hydrangea macrophylla ‘Pillnitz’ but inhibited that of Hydrangea macrophylla ‘Cotton Candy’， Hydrangea macrophylla ‘Tricolor’ and" Hydrangea strigosa. The orthogonal experiment indicated that the optimal culture medium compositions for the pollen germination of Hydrangea macrophylla ‘Cotton Candy’ and， Hydrangea macrophylla ‘Tricolor’ were 100 g/L sucrose， 300 mg/L boric acid and， 15 mg/L calcium chloride， and the corresponding germination rates were 32.65% and 35.07%， respectively. The best medium composition for the pollen germination of Hydrangea macrophylla ‘Pillnitz’ was 150 g/L sucrose， 150 mg/L boric acid and， 15 mg/L calcium chloride， and the corresponding germination rate was 83.59%. The optimal medium composition for the pollen germination of Hydrangea strigosa was 30 g/L sucrose， 30 mg/L boric acid and， 15 mg/L calcium chloride， and the corresponding germination rate was"" 21.38%. The optimum light intensity and temperatures for the pollen germinations of four Hydrangea species were 200 lx and 25-30 ℃， respectively. The optimum temperatures of the short-term pollen storage was -80 ℃ for Hydrangea macrophylla ‘Cotton Candy’， Hydrangea macrophylla ‘Pillnitz’ ， Hydrangea macrophylla ‘Tricolor’ and， -20 ℃ for Hydrangea strigosa.

Key words Hydrangea pollen; Germination in vitro; Orthogonal design;Storage temperature; Light intensity

Received "2023-04-23 """Returned 2023-06-12

Foundation item The Key Research and Development Program of Shaanxi Province（No.2022NY-180）; the Key Research and Development Program of Shaanxi Province， Key Industry Innovation Chain （Group）-Agricultural Project（No.2022ZDLNY03-09）.

First author LIU Guoyu， female， associate research fellow.Research area：introduction and acclimation， cultivation， variety breeding and medicinal composition of ornamental plant. E-mail：liuguoyu1983@126.com

Corresponding"" author LI Yan， female， research fellow.Research area：introduction and acclimation， cultivation physiology and landscape configuration of ornamental plant. E-mail：5214352@126.com

（责任编辑：郭柏寿 Responsible editor：GUO Baishou）