狂犬病病毒突变株rRC-HL（GX074P1M1）的构建及其生物学特性

摘要：【目的】构建狂犬病病毒（RABV）突变株rRC-HL（GX074P1M1）并探究其生物学特性，分析磷蛋白（P）与基质蛋白（M）部分区域联合突变对RABV转录和复制水平的影响，以了解RABV的致病机制，为靶点预防与治疗提供理论依据。【方法】通过反向遗传学技术，将RABV街毒株GX074的P蛋白P1区域（第48～78位氨基酸）与M蛋白M1区域（第1～22位氨基酸）联合嵌入弱毒株RC-HL相应位置，通过间接免疫荧光试验（IFA）、实时荧光定量PCR和Western blotting分别测定突变毒株和对照毒株［RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）和CVS-11］感染细胞BSR/T7-9后的病毒滴度与核蛋白（N）基因、P基因和M基因及其蛋白相对表达量。【结果】通过病毒拯救成功获得突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）。病毒多步生长曲线测定结果显示，感染BSR/T7-9细胞24～96 h内，突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）的病毒滴度均高于亲本毒株RC-HL和GX074。通过实时荧光定量PCR检测发现，突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）在感染24和48 h时，N基因、P基因和M基因的相对表达量均显著（Plt;0.05）或极显著（Plt;0.01，下同）高于亲本毒株RC-HL和GX074。Western blotting检测结果显示，在感染24 h时，与亲本毒株RC-HL相比，突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N蛋白、P蛋白和M蛋白相对表达量均小幅上升；在感染48 h时，突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N蛋白、P蛋白和M蛋白相对表达量均极显著高于亲本毒株RC-HL与GX074。【结论】RABV街毒株GX074的P1和M1区域联合嵌入弱毒株RC-HL获得的突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）复制及转录水平比亲本毒株高，在细胞内具有更强的增殖能力，表明街毒株GX074的P蛋白P1区域和M蛋白M1区域在促进病毒转录及复制中发挥协同作用。

关键词：狂犬病病毒（RABV）；GX074；RC-HL；P1；M1；生长特性；反向遗传

中图分类号：S852.659.5文献标志码：A文章编号：2095-1191（2024）10-3106-11

Construction of rabies virus mutant strain rRC-HL（GX074P1M1）and its biological characteristics

LI Wen-fang1，2，PENG Jing1，2，LUO Xi1，2，YANG Wen-hao1，2，WEI Xian-kai1，2，LI Xiao-ning1，2，3*，LUO Ting-rong1，2，3，4*

（1College of Animal Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China；2State Key Labo-ratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Nanning，Guangxi 530004，China；3GuangxiVeterinary Biological Products Engineering Research Center，Nanning，Guangxi 530004，China；4Guangxi Key Labora-tory of Animal Breedingamp;Disease Control and Prevention，Nanning，Guangxi 530004，China）

Abstract：【Objective】The objective of this study was to construct the rabies virus（RABV）mutant strain rRC-HL（GX074P1M1）and investigate its biological characteristics，analyzed the impact of combined mutations in the phospho-protein（P）and matrix protein（M）regions on RABV transcription and replication levels，in order to study the patho-genic mechanisms of RABV and provide theoretical basis for targeted prevention and treatment.【Method】Using reverse genetics technology，the P protein P1 region（amino acids at positions 48-78）and M protein M1 region（amino acids atpositions 1-22）of the RABV street strain GX074 were co-embedded into the corresponding positions of the attenuatedstrain RC-HL.The virus titers and the relative expression levels of the nucleoprotein（N）gene，P gene，and M gene，as well as their proteins were determined for the mutant strain and control strains［RC-HL，GX074，rRC-HL（GX074PM），and CVS-11］after infection of BSR/T7-9 cells using indirect immunofluorescence assay（IFA），real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting.【Result】The mutant strain rRC-HL（GX074P1M1）was successfully obtainedthrough virus rescue.Multi-step virus growth curve assays showed that the virus titer of the mutant strain rRC-HL（GX074P1M1）was higher than that of the parental strains RC-HL and GX074 within 24-96 h post infection of BSR/T7-9 cells.Real-time fluorescence quantitative PCR revealed that the relative expression levels of the N gene，P gene and M gene of the mutant strain rRC-HL（GX074P1M1）were significantly（rlt;0.05）or extremely significantly（rlt;0.01，thesame below）higher than those of the parental strains RC-HL and GX074 at 24 and 48 h post infection.Westernblottingresults indicated that at 24 hpost infection，the relative expression levels of N protein，P protein and M proteins in the mu-tant strain rRC-HL（GX074P1M1）were slightly higher than those in the parental strain RC-HL.At 48 h post infection，the relative expression levels of N protein，P protein and M proteins in the mutantstrainrRC-HL（GX074P1M1）were ex-tremely significantly higher than those in the parental strains RC-HL and GX074.【Conclusion】The mutantstrainrRC-HL（GX074P1M1），obtained by co-embedding the P1 and M1 regions of the RABV street strain GX074 into the attenuatedstrain RC-HL，exhibits higher replication and transcription levels than the parental strains，indicating a stronger intracellu-lar proliferation capability.This suggests that the P protein P1 region and M protein M1 region of the street strain GX074 play synergistic effects in promoting viral transcription and replication.

Key words：rabies virus（RABV）；GX074；RC-HL；P1；M1；growth characteristics；reverse inheritance

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32070161，31570147）；Guangxi Natural Science Foundation（2020GXNSFAA297212）

0引言

【研究意义】狂犬病是一种由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的接触性人兽共患传染病，一旦出现临床症状几乎100%死亡，据世界卫生组织报道，全世界每年死于狂犬病的人数高达5.9万。RABV因具有血脑屏障穿透性而不易用药物治疗，各国控制狂犬病流行均采用以注射疫苗为主的预防措施，进行精细的RABV结构研究，对提高疫苗针对性尤为重要。【前人研究进展】RABV隶属于弹状病毒科狂犬病病毒属，其基因组全长约12 kb，为不分节段的单股负链RNA，从3'端至5'端依次编码5种结构蛋白，分别为核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和病毒RNA聚合酶蛋白（L）（Hidaka et al.，2018）。RABV的P蛋白由297个氨基酸组成，具有高度亲水性，P基因通过特定的翻译机制可翻译出5种不同大小的P蛋白，这些P蛋白定位在细胞的不同位置，发挥重要功能（Cheniketal.，1995）。RABV的P蛋白是与核糖核蛋白（RNP）复合物一起形成螺旋状核壳的重要中间体，P蛋白在N-RNA模板上能正确定位，因为P蛋白具有2个独立的N蛋白结合区域，分别位于C端和N端，较强的结合区域位于P蛋白C端，与N-RNA复合物中的N蛋白结合，较弱的结合区域位于P蛋白N端，主要结合新产生的N蛋白（Liu et al.，2004；Mavrakis et al.，2004，2006）。P蛋白阻止N蛋白与细胞RNA结合，对病毒的复制和转录起重要作用（Jacob et al.，2001）。P蛋白可与信号转导和转录激活因子1（STAT1）（Vidy et al.，2005；Zhan et al.，2021）、黏着斑激酶（Fouquet et al.，2015）、热休克蛋白90（Hsp90）（Xu et al.，2016）、自噬蛋白Beclin 1（Liu et al.，2017）、Rho家族GTP酶Rac1（徐婧，2023）等多种宿主蛋白直接或间接作用以调控宿主抗病毒功能。RABV的M蛋白是负链RNA病毒的重要结构蛋白，对病毒的组装和出芽具有重要作用。M蛋白由202个氨基酸组成，是RABV结构蛋白中最小的，但其变异频率却较大（Mebatsionetal.，1999）。M蛋白位于RABV粒子的囊膜下，连接RNP和G蛋白（Guichard etal.，2011）。M蛋白通过与宿主的多种蛋白相互作用来实现促进病毒转录与复制的功能，其利用富含脯氨酸的基序与细胞蛋白的WW结构域相互作用，促进病毒出芽（Hartyet al.，1999）；M蛋白可与NF-κB家族蛋白RelAp43结合，抑制病毒感染后期与先天免疫相关的NF-κB依赖性基因表达（Ben Khalifa et al.，2016；Besson etal.，2017）；Zan等（2016）研究发现，M蛋白能以线粒体为靶标，在病毒感染后期诱导线粒体凋亡，以促进病毒的复制和传播；刘杏（2020）研究发现，V型ATP酶转运亚基A（ATP6V1A）与M蛋白相互作用，促进病毒的复制；张曦等（2023）研究发现，M蛋白第74位氨基酸（组氨酸）对M蛋白定位至线粒体有重要影响；此外，Zhang等（2023）研究发现，M蛋白可劫持宿主蛋白Desmin，实现病毒成分在细胞内的有效转运，从而帮助病毒出芽。RABV的反向遗传学技术逐渐发展成熟，Schnell等（1994）用痘病毒感染刺激细胞从而促进细胞表达RNA聚合酶；Buchholz等（1999）构建了能稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞系；Inoue等（2003）建立依赖于细胞聚合酶Ⅱ，两端分别连接锤头状核酶和丁型肝炎病毒核酶，并接合在pcDNA3.1/Zeo（+）载体CMV启动子下游的RABV全长质粒系统；Ito等（2003）构建了含有RC-HL毒株全长基因组的质粒pRC-HL（+）与含有RC-HL毒株N基因、P基因和L基因序列的3个辅助质粒pcDNA-RN、pcDNA-RP及pcDNA-RL，是RABV基因功能研究的重要工具。本课题组前期分离获得了广西街毒株GX074，通过反向遗传技术将街毒株GX074的P基因和M基因替换至弱毒株RC-HL相应位置进行联合突变，结果发现病毒致病性提高，且突变毒株rRC-HL（GX074PM）的复制水平介于亲本弱毒株和街毒株之间；进一步研究发现，将街毒株GX074的M蛋白第1～22位氨基酸与P蛋白全长联合替换至弱毒株RC-HL相应位置，或将街毒株GX074的P蛋白第48～78位氨基酸与M蛋白全长联合替换至弱毒株RC-HL相应位置，获得的突变毒株在细胞内的复制能力均与亲本弱毒株RC-HL相似，但明显高于亲本街毒株GX074（陆丽莹等，2022；周桂全等，2023）。【本研究切入点】在前期研究的基础上，进一步探究RABV的P蛋白P1区域（第48～78位氨基酸）和M蛋白M1区域（第1～22位氨基酸）联合突变的影响。【拟解决的关键问题】通过反向遗传学技术，将街毒株GX074的P蛋白P1区域与M蛋白M1区域联合嵌入弱毒株RC-HL相应位置，构建RABV突变株并探究其生物学特性，通过间接免疫荧光试验（IFA）、实时荧光定量PCR和Western blotting分别测定突变毒株和对照毒株感染BSR/T7-9细胞后的病毒滴度与N基因、P基因和M基因及其蛋白相对表达量。分析P1和M1区域联合突变对RABV转录和复制水平的影响，以了解RABV的致病机制，为靶点预防与治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

pRC-HL质粒与辅助质粒pT7IRES-N、pT7IRES-P和pT7IRES-L均由日本岐阜大学源宣之教授惠赠；pRC-HL（GX074P1M）和pRC-HL（GX074PM1）感染性cDNA克隆均为本课题组前期研究构建保存；BSR/T7-9细胞系与RABV固定毒株CVS-11和弱毒株RC-HL均由亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室保存提供；RABV街毒株GX074为本课题组前期研究分离保存；RABV突变毒株rRC-HL（GX074PM）为本课题组前期研究拯救保存；限制性内切酶AgeⅠ购自美国NEB公司；限制性内切酶SacⅡ、PrimeSTAR MAX Premix（2×）、反转录酶M-MLV和RNA酶抑制剂均购自日本TaKaRa公司；2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；LipofectamineTM 2000转染试剂、DMEM培养基粉末、Opti-MEMTM减血清培养基和GeneJET凝胶回收试剂盒均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；无内毒素质粒抽提试剂盒购自美国Omega Bio-Tek公司；2×Taq PCR MasterMixⅡ和大肠杆菌TOP10感受态细胞均购自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清（FBS）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；RABV N蛋白鼠源单克隆抗体和免疫荧光染色试剂盒（含抗小鼠Alexa Fluor 488）均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；内参蛋白β-Actin鼠源单克隆抗体购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司。

1.2引物设计与合成

根据GenBank已公布的RC-HL毒株基因组序列（登录号AB009663）和本课题组前期研究测序获得的GX074毒株基因组序列，比对弱毒株RC-HL和街毒株GX074的P蛋白氨基酸序列P1区域及M蛋白氨基酸序列M1区域（图1），设计将GX074毒株P基因P1片段和M基因M1片段替换至RC-HL毒株相应位置的cDNA克隆引物（表1），委托南宁捷尼斯生物科技有限公司合成。

1.3 RABV突变株感染性cDNA克隆的构建

以pRC-HL（GX074P1M）质粒为模板，采用含有AgeⅠ酶切位点的引物AgeⅠ-F和含有重叠片段的引物P1-R扩增P1片段，以pRC-HL（GX074PM1）质粒为模板，利用含有SacⅡ酶切位点的引物SacⅡ-R和含有重叠片段的引物M1-F扩增M1片段，通过重叠PCR将2个片段进行连接获得P1M1片段。采用限制性内切酶AgeⅠ和SacⅡ对pRC-HL质粒进行双酶切获得线性化载体，利用同源重组一步法克隆试剂盒将P1M1片段连接至线性化载体，以连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在LA培养基中培养过夜，挑取单菌落扩大培养后进行测序。

1.4 RABV突变株的拯救

将BSR/T7-9细胞接种至12孔细胞培养板进行培养，当细胞密度达70%～90%时进行转染。感染性cDNA克隆与辅助质粒pT7IRES-N、pT7IRES-P和pT7IRES-L分别取2.0、0.4、0.1和0.2μL，用200.0μL Opti-MEMTM减血清培养基溶解混匀；同时，取4.0μL脂质体LipofectamineTM 2000于200.0μLOpti-MEMTM减血清培养基中溶解混匀，室温静置5 min；将质粒和脂质体溶解液混合，室温静置20min。弃去12孔细胞培养板内细胞培养液，用DMEM培养基洗涤2次，将质粒和脂质体混合液加入12孔细胞培养板中，每孔400.0μL，置于含5%CO2的37℃恒温培养箱进行培养，6 h后弃去上清液，更换为含2%FBS的DMEM培养基，每孔1 mL，至培养第3 d时每孔再补充1 mL含2%FBS的DMEM。培养6 d后将12孔细胞培养板置于-80℃超低温冰箱冻融2次，收集冻融液，4℃下12000 r/min离心5 min，-80℃保存备用。

将冻融液接种至96孔细胞培养板培养的细胞中，每孔100.0μL，接种2 h后更换为含2%FBS和1%甲基纤维素的DMEM，48 h后通过IFA检测细胞中特异性病毒荧光灶形成情况。根据检测结果，将含有病毒粒子的冻融液接种至BSR/T7-9细胞中盲传3代，提取盲传3代后的细胞冻融液总RNA并反转录合成cDNA，用引物AgeⅠ-F和SacⅡ-R扩增目的片段，胶回收后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。

1.5 RABV突变株的多步生长曲线测定

测定突变毒株与对照毒株RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）和CVS-11的病毒滴度，然后按感染复数（MOI）为0.01的剂量接种至24孔细胞培养板培养的BSR/T7-9细胞中，分别收集感染后24、48、72和96 h的上清液，采用IFA测定不同感染时间的病毒滴度，使用GraphPad Prism 9.0绘制病毒的多步生长曲线。

1.6 RABV突变株的结构蛋白基因相对表达量测定

将突变病毒株与对照毒株RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）和CVS-11以0.1 MOI的剂量接种至24孔细胞培养板培养的BSR/T7-9细胞中。分别于感染后24和48h收集细胞样品，提取样品总RNA并反转录合成cDNA，采用实时荧光定量PCR检测N基因、P基因和M基因相对表达量，引物信息见表2。PCR反应体系10.0μL：cDNA模板2.0μL，2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 5.0μL，上、下游引物各0.5μL，超纯水2.0μL。扩增程序：95℃预变性3min；95℃5 s，60℃30 s，进行40个循环。采用LightCy-cler 96实时荧光定量PCR仪［罗氏诊断产品（上海）有限公司］进行检测，通过2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.7 RABV突变株的结构蛋白相对表达量测定

病毒接种方法同1.6，收集感染后24和48h的细胞样品，用含10%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解，通过Western blotting检测突变毒株与对照毒株RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）及CVS-11的N蛋白、P蛋白和M蛋白相对表达量。

1.8统计分析

采用Excel 2021对试验数据进行整理，使用SPSS 26.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA），利用GraphPad Prism 9.0制图。

2结果与分析

2.1 RABV突变株感染性cDNA克隆的构建结果

RABV突变株感染性cDNA克隆的构建策略如图2-A所示，以pRC-HL（GX074P1M）质粒为模板，采用引物AgeⅠ-F和P1-R扩增出P1片段，以pRC-HL（GX074PM1）质粒为模板，利用引物SacⅡ-R和M1-F扩增出M1片段，产物大小符合预期（图2-B）；通过重叠PCR将P1和M1片段连接得到P1M1片段，与预期大小一致（图2-C）；采用限制性内切酶AgeⅠ和SacⅡ对pRC-HL质粒进行双酶切获得线性化载体（图2-D），利用同源重组一步法克隆试剂盒将P1M1片段连接至线性化载体，以连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在LA培养基中培养过夜，挑取单菌落扩大培养后进行测序，经鉴定成功构建RABV突变株感染性cDNA克隆pRC-HL（GX074P1M1）。

2.2 RABV突变株的拯救结果

通过IFA检测到拯救的RABV突变株在细胞间传播形成特异性荧光灶，与对照毒株RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）和CVS-11在细胞间形成的荧光灶形状相似（图3-A），初步判断pRC-HL（GX074P1M1）质粒转染BSR/T7-9细胞后有病毒粒子形成；提取接种病毒后盲传3代的细胞冻融液总RNA并反转录合成cDNA，经PCR扩增后进行测序，结果表明RABV突变株rRC-HL（GX074P1M1）拯救成功（图3-B）。

2.3 RABV突变株的多步生长曲线测定结果

将突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）与对照毒株RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）和CVS-11接种至BSR/T7-9细胞，通过IFA检测不同感染时间的病毒滴度，绘制病毒多步生长曲线，结果如图4所示。感染24～96 h内，突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）的病毒滴度均高于亲本弱毒株RC-HL和亲本街毒株GX074，生长趋势与亲本弱毒株RC-HL相似。对照突变毒株rRC-HL（GX074PM）在感染24h时的病毒滴度介于亲本弱毒株RC-HL和亲本街毒株GX074之间，感染72h后病毒滴度高于上述亲本毒株。突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）的病毒滴度在感染48 h前高于rRC-HL（GX074PM）毒株，感染72 h后病毒滴度低于rRC-HL（GX074PM）毒株。固定毒株CVS-11在病毒滴度在感染24h后快速升高，但感染24～96 h内其病毒滴度均低于RC-HL毒株。

2.4 RABV突变株的结构蛋白基因相对表达量测定结果

通过实时荧光定量PCR检测突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）与对照毒株RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）和CVS-11在感染BSR/T7-9细胞后N基因、P基因及M基因的相对表达量，结果如图5所示。感染24 h时，突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N基因和M基因的相对表达量均极显著高于亲本弱毒株RC-HL（Plt;0.01，下同），P基因的相对表达量显著高于亲本弱毒株RC-HL（Plt;0.05，下同）；在感染48 h时，突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N基因、P基因和M基因相对表达量均极显著高于亲本弱毒株RC-HL。在感染24和48 h时，对照突变毒株rRC-HL（GX074PM）的N基因、P基因和M基因相对表达量均显著或极显著低于突变毒株rRC-HL（GX074P1M1），而与亲本弱毒株RC-HL的N基因、P基因和M基因相对表达量差异较小。CVS-11毒株N基因、P基因和M基因的相对表达量在感染24和48 h时均显著或极显著低于突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）。街毒株GX074的N基因、P基因和M基因相对表达量在感染24和48 h时均低于突变毒株rRC-HL（GX074P1M1），其中N基因和M基因在感染24和48 h时均差异极显著，P基因在感染24 h时差异显著，在感染48 h时差异极显著。突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）N基因、P基因和M基因的相对表达量较亲本毒株RC-HL上调，与多步生长曲线显示的病毒滴度上调结果一致，说明RABV的P1和M1片段联合突变同时提高了病毒的复制水平和转录水平。

2.5 RABV突变株的结构蛋白相对表达量测定结果

突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）与对照毒株RC-HL、GX074、rRC-HL（GX074PM）和CVS-11感染BSR/T7-9细胞后，通过Western blotting检测病毒N蛋白、P蛋白和M蛋白的相对表达量。结果（图6）显示，在感染24h时，突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N蛋白、P蛋白和M蛋白相对表达量均较亲本弱毒株RC-HL小幅上升，但差异不显著（rgt;0.05，下同）；感染48h时，突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N蛋白、P蛋白和M蛋白相对表达量均极显著高于亲本毒株RC-HL。感染24 h时，对照突变毒株rRC-HL（GX074PM）的N蛋白和P蛋白相对表达量均与突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）无显著差异，但M蛋白的相对表达量较突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）极显著降低；感染48 h时，rRC-HL（GX074PM）毒株N蛋白、P蛋白和M蛋白的相对表达量均极显著低于突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）。感染24 h时，CVS-11毒株N蛋白和M蛋白的相对表达量均极显著低于突变毒株rRC-HL（GX074P1M1），但P蛋白的相对表达量无显著差异；感染48 h时，CVS-11毒株N蛋白、P蛋白和M蛋白的相对表达量均显著低于突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）。感染24 h时，GX074毒株P蛋白的相对表达量与突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）无显著差异，而N蛋白和M蛋白的相对表达量均极显著低于突变毒株rRC-HL（GX074P1 M1）；感染48 h时，GX074毒株N蛋白、P蛋白和M蛋白的相对表达量均显著均极显著低于突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）。感染24 h时，突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N蛋白、P蛋白和M蛋白相对表达量均高于亲本弱毒株RC-HL和亲本街毒株GX074，与多步生长曲线显示的病毒滴度变化趋势一致，进一步说明P1和M1区域联合突变对病毒复制有促进作用。

3讨论

RABV的RNP复合物在病毒组装和复制中起关键作用，RABV的P蛋白作为病毒螺旋状核壳的组成部分可影响病毒复制，且同为核壳重要组成部分的RNP复合物形成受N蛋白、P蛋白和L蛋白比例影响（Pattnaik and Wertz，1990；Mei et al.，2017），表明低水平的P基因表达可通过阻碍RNP形成来限制病毒复制。通过同时修饰RABV的P蛋白动力蛋白轻链结合位点和替换G蛋白的第333位氨基酸（精氨酸）可致弱病毒（Mebatsion，2001）。P蛋白被认为是主要的干扰素拮抗剂，因为其能结合信号转导和转录激活因子（STAT），通过P蛋白的强输出序列引起P-STAT复合物的核排斥（Wiltzeretal.，2014）。M蛋白是调节病毒转录与复制的重要成分。研究表明，M蛋白表达可调节RABV基因组的转录和复制（Finke et al.，2003）；M蛋白的第58位氨基酸对RABV的复制也至关重要（Finke and Conzelmann，2003）。将M基因在RABV全基因组中的顺序进行重排能致弱病毒（Yang et al.，2014）。相关研究发现，M蛋白能与RelAp43相互作用调节NF-κB通路，在干扰素的刺激下M蛋白和P蛋白配合与STAT1相互作用，共同调节Jak-Stat通路，P蛋白和M蛋白能调节对方少数氨基酸突变在该通路上引起的改变（Ben Khalifa et al.，2016；Sonthonnax et al.，2019）。M蛋白的过度表达会增加组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）的表达，通过微管解聚增强RABV的转录和复制（Zan etal.，2017）。

本研究将街毒株GX074的P1和M1片段嵌入弱毒株RC-HL获得突变毒株rRC-HL（GX074P1M1），在感染BSR/T7-9细胞24和48h时，突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）的N基因、P基因和M基因相对表达量均显著或极显著高于亲本弱毒株RC-HL和亲本街毒株GX074。本课题组前期研究中，将街毒株GX074的P基因和M基因联合替换至弱毒株RC-HL获得突变毒株rRC-HL（GX074PM），其N基因、P基因和M基因的相对表达量在感染24和48h时均显著或极显著低于突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）。以上研究结果表明，RABV的P基因和M基因联合突变区域不同对病毒的转录和复制水平调节会产生不同影响，可能是由于突变区域不同引起病毒蛋白参与的信号通路变化，从而影响病毒在细胞内的复制和转录水平。

Tian等（2017）研究表明，RABV野毒株GD-SH-01的P基因嵌合至实验室减毒株HEP-Flury获得的突变毒株rHEP-SH-P在体外的增殖能力较差；而Long等（2020）研究发现，rHEP-SH-P毒株在体内的生长相对较慢，P基因也被抑制。本课题组前期研究中，将街毒株GX074的P基因与街毒株GX01的M基因共同嵌合至弱毒株RC-HL获得突变毒株rRC-HL（074P-01M），将GX074毒株的M基因与GX01毒株的P基因共同嵌合至弱毒株RC-HL获得突变毒株rRC-HL（01P-074M），突变毒株与亲本弱毒株RC-HL相比复制效率均降低（陈俊蓉等，2022）；此外还发现，GX074毒株的P基因和M基因共同嵌合至RC-HL毒株获得的突变毒株复制效率比亲本毒株RC-HL低；将GX074毒株P基因的部分片段与M基因全长联合嵌入RC-HL毒株，或将GX074毒株的M基因部分片段与P基因全长联合嵌入RC-HL毒株，获得的突变毒株复制能力均与亲本毒株RC-HL相似（陆丽莹等，2022；周桂全等，2023）。本研究的多步生长曲线测定结果显示，将GX074毒株的P蛋白P1区域与M蛋白M1区域联合嵌入弱毒株RC-HL获得的突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）在BSR/T7-9细胞内增殖能力比亲本弱毒株RC-HL和亲本街毒株GX074强，生长趋势与亲本弱毒株RC-HL相似，说明P蛋白和M蛋白全长联合突变与部分区域联合突变所起的作用存在差异，推测是由于蛋白内氨基酸残基改变后引起病毒三维结构改变，进而影响病毒生长特性，也可能是由于改变了病毒与宿主相互作用的部分蛋白的结合位点，从而使突变毒株呈现不同生长特性。同时，突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）的复制和转录水平高于亲本毒株GX074和RC-HL，具有更强的增殖能力，表明RABV街毒株GX074的P蛋白P1区域和M蛋白M1区域在促进病毒转录和复制中发挥协同作用。后续研究将进一步探索P1和M1区域中哪些氨基酸位点对协同影响病毒转录和复制起关键作用。

4结论

RABV街毒株GX074的P1和M1区域联合嵌入弱毒株RC-HL获得的突变毒株rRC-HL（GX074P1M1）复制及转录水平比亲本毒株高，在细胞内具有更强的增殖能力，表明街毒株GX074的P蛋白P1区域和M蛋白M1区域在促进病毒转录及复制中发挥协同作用。

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（责任编辑刘可丹）