贵州烟草根结线虫种类鉴定及其与根茎类病害混合侵染情况调查

摘要：【目的】明确贵州主要烟区烟草根结线虫种类、分布、发生规律及其与烟草主要根茎类病害混合发生情况，为贵州抗根结线虫烟草品种选育、烟叶生产布局、根结线虫病综合防治策略制定提供科学依据。【方法】以采集自贵州9个市（州）主栽烟区98份疑似烟草根结线虫病根样本为材料，使用染色镜检、雌虫会阴花纹形态观察及分子生物学方法对根结线虫种类进行鉴定；采用染色法和贝曼漏斗法对根结线虫发生规律（根结线虫大田初侵染期、生活史周期及土壤线虫数量变化规律）进行调查；采用PCR技术对根结线虫病根样本中烟草黑胫病菌（Phytophthora nicotianae）、根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）和青枯病菌（Ralstonia solanacearum）进行检测。【结果】98份样本中有49份感染根结线虫，其中21份为花生根结线虫（Meloidogyne arenaria）单一侵染，占42.86%，为当前贵州烟草根结线虫的优势种群；11份为南方根结线虫（M.incognita）单一侵染，占22.45%；花生根结线虫与南方根结线虫混合种群、花生根结线虫与爪哇根结线虫（M.javanica）混合种群侵染占比分别为30.61%和2.04%；1份未检测出线虫，占2.04%。从各产区来看，毕节市主要为花生根结线虫单一侵染和花生根结线虫与南方根结线虫混合侵染，安顺市和贵阳市为花生根结线虫单一侵染，六盘水市主要为花生根结线虫单一侵染，黔东南州和黔南州为南方根结线虫单一侵染及花生根结线虫与南方根结线虫混合侵染，黔西南州主要为花生根结线虫单一侵染，铜仁市为南方根结线虫单一侵染和花生根结线虫与南方根结线虫混合侵染，遵义市主要为花生根结线虫与南方根结线虫混合侵染。黑胫病、根黑腐病和青枯病等根茎类病害易与根结线虫混合侵染，3种病原菌的检出率分别为4.1%、6.1%和20.4%。根结线虫初侵染期为栽后5～10 d，生活史周期约35 d；移栽后第15、20、25、30、35、40 d时每100 g土壤中根结线虫2龄幼虫数量分别为96、74、59、38、60和83条，呈先减少后逐渐增加的趋势。【结论】贵州烟区根结线虫种类有南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫，花生根结线虫为优势种群；9个市（州）主栽烟区均有根结线虫危害；根结线虫初侵染期为栽后5～10 d，生活史周期约35 d，根围土壤中根结线虫2龄幼虫数量随着侵染时间的推移呈先减少后逐渐增加的趋势；根结线虫不同种群混合侵染，与青枯病、黑胫病及根黑腐病混合发生情况普遍。

关键词：烟草；根结线虫；种类分布；混合侵染；贵州

中图分类号：S435.72文献标志码：A文章编号：2095-1191（2024）10-3013-10

Identification of tobacco root-knot nematode species and surveyon their mixed infestations with root and tuber diseasesin Guizhou

WU Xiu-qing1，2，LI Cai-bin3，LUO Jie4，MA Gui-mei5，LU Ning1，CHEN Xing-jiang1，CAO Yi1*

（1Guizhou Institute of Tobacco Science，Guiyang，Guizhou 550081，China；2School of Tobacco，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China；3Bijie Company，Guizhou Tobacco Company，Bijie，Guizhou 551700，China；4Qianxinan Company，Guizhou Tobacco Company，Xingyi，Guizhou 562400，China；5School of Life Sciences，YunnanUniversity，Kunming，Yunnan 650500，China）

Abstract：【Objective】To clarify the distribution of tobacco root-knot nematode species，the occurrence pattern and its mixed infestations with major root and stem diseases in major tobacco areas of Guizhou，and to provide scientific basis for the selection and breeding of root-knot nematode resistant tobacco varieties，tobacco production layout，and the for-mulation of integrated control strategies for root-knot nematode diseases in Guizhou.【Method】Using 98 samples of to-bacco root-knot nematode infected roots collected from the main planting areas of 9 cities（prefecture）in Guizhou as ma-terials，and the root-knot nematode species were identified by staining microscopy，morphological observation of the fe-male perineal pattern，and molecular biology methods；the root-knot nematode incidence patterns（the initial infestation period of the root-knot nematode in the field，the life-history cycle，and the change pattern of the number of nematodes in the soil）were investigated using the dyeing and the Behmann funnel methods；and PCR technology was used to test Phy-tophthoranicotianae，Thielaviopsis basicola and Ralstonia solanacearum in root-knot nematode root samples.【Result】A total of 49 of the 98 samples were infested with root-knot nematodes，of which 21 samples（42.86%）were singly infested with Meloidogynearenaria，the dominant population in Guizhou；and 11 samples（22.45%）were singly infested with M.incognita.Infestation rates of M.arenaria and M.incognita mixed population，M.arenaria and M.javanica mixed popula-tion were 30.61%and 2.04%respectively；there was 1 sample detected no root-knot nematode，which accounted for 2.04%.From the producing areas，Bijie City mainly had single infestation of M.arenaria and compound infestation ofM.arenaria and M.incognita，Anshun City and Guiyang City had infestation by single M.arenaria，Liupanshui City had mainly single infestation of M.arenaria，Qiandongnan Prefecture and Qiannan Prefecture had single infestation of M.in-cognita and compound infestation of M.incognita and M.arenaria，Qianxinan mainly had single infestation of M.are-naria，Tongren City had single infestation of M.incognita and complex infestation of M.incognita and M.arenaria，Zunyi City mainly had compound infestation of M.arenaria and M.incognita.Rhizome diseases such as black shank，root black rot and bacterial wilt wee prone to mixed infection with root-knot nematodes，the detection rates of black shank pathogen，root black rot pathogen and bacterial wilt pathogen were 4.1%，6.1%，and 20.4%；the initial infestation period of root-knot nematode was 5-10 d after planting，and it took about 35 d to complete a life history cycle；the numbers of second instar of root-knot nematode per 100 g of soil at 15th，20th，25th，30th，35th and 40th d after transplanting were 96，74，59，38，60，and 83 respectively，with a decreasing and increasing trend.【Conclusion】Root-knot nematode species in Guizhou tobacco area include M.incognita，M.arenaria，M.javanica，with M.arenaria as the dominant species；root-knot nematode is found in the main planting areas of 9 cities（prefecture）；the initial infestation period of root-knot nema-tode is 5-10 dafter planting，and the life-history cycle lasts for about 35 d，and the number of second instar larva of root-knot nematode in soil around roots shows the tendency to decrease first and then increase gradually with the increase of infestation time；mixed infestation of different populations of root-knot nematode，as well as mixed with bacterial wilt，black shank and root black rot is common.

Key words：tobacco；root-knot nematode；species distribution；mixed infestation；Guizhou

Foundation items：Major Science and Technology Project of China National Tobacco Corporation［110202101055（LS-15）］；Science and Technology Project of Guizhou Company of China National Tobacco Corporation（2021XM12，2023XM05）

0引言

【研究意义】植物寄生线虫被广泛认为是植物侵染性病害的主要病原之一，全球每年因线虫病侵染造成的经济损失高达1730亿美元（Ellinget al.，2013）。目前，根结线虫病在我国主要烟区均有发生，严重时可造成30%～50%的损失，该病造成的烟叶经济损失占侵染性病害所致损失的5.7%，且危害程度逐年上升，严重制约着烟草产业发展（徐兴阳等，2017；陆惠光等，2018；张宗锦等，2019；马桂妹等，2023）。据报道，贵州作为我国第二大烟叶产区，年均烟草种植面积约13.33万ha、产量20万t，因线虫病常年损失30%～50%（马云飞等，2020；李彩斌等，2021）。根结线虫还可诱发其他根茎类病害，从而加大经济损失（陆惠光等，2018）。因此，对贵州省各烟区根结线虫种类进行鉴定，调查其分布及与其他根茎类病害混合侵染情况和发生规律，对贵州烟草根结线虫病的精准防控具有重要意义。【前人研究进展】焦永吉等（2014）通过线虫样本PCR分子检测与雌成虫会阴花纹形态鉴定相结合的方法对河南省8个县烟草根结线虫进行种类鉴定，发现产生危害的有南方根结线虫（Meloidogyne incognita）、花生根结线虫（M.arenaria）、北方根结线虫（M.hapla）和爪哇根结线虫（M.javanica），其中南方根结线虫为优势种群；杨艳梅等（2017）采用雌成虫会阴花纹形态观察及分子生物学检测对云南省昆明、曲靖和玉溪3地烟草根结线虫种类进行鉴定，发现产生危害的有南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫，花生根结线虫为优势种群；江其朋等（2021）采用形态学与分子生物学相结合的方法对危害四川凉山州会理县黎溪镇的烟草根结线虫种类进行鉴定，发现产生危害的是南方根结线虫；李彩斌等（2021）采用田间调查及室内外部形态鉴定方法对毕节烟草根结线虫种类进行鉴定，发现出产生危害的有南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫，南方根结线虫为优势种群。根结线虫除在烟草上产生危害外，还在水稻、药材、蔬菜和水果上产生危害。Wang等（2015）和Cao等（2023）首次对辣椒和玉米上根结线虫进行报道，其病原种类分别为象耳豆根结线虫（M.enterolobii）和rDNA-ITS花生根结线虫；陈昆圆等（2022）采用形态学、rDNA-ITS序列分析和特异性引物扩增相结合的方法对河南省许昌市、三门峡市和南阳市等丹参种植园区的丹参根结线虫进行种类鉴定，鉴定产生危害的是南方根结线虫；徐幸等（2023）利用生物测定和根结线虫特异性引物对中国南方15个省（直辖市/自治区）的水稻根结线虫进行鉴定，鉴定产生危害的有拟禾本科根结线虫（M.gramini-cola）、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫、象耳豆根结线虫和南方根结线虫，拟禾本科根结线虫为优势种群；Wu等（2023）采用形态学与分子生物学相结合的方法首次对云南和四川等地乌头根结线虫进行鉴定，鉴定产生危害的是北方根结线虫；陈京环等（2024）采用形态学、分子生物学和室内人工接种法对甘肃陇西县黄芩根结线虫进行鉴定，鉴定产生危害的是北方根结线虫。【本研究切入点】当前，贵州烟区未对根结线虫的种类分布、优势种群、发生规律及其与烟草主要根茎类病害混合发生情况进行系统调查和研究，导致育种、生产和植保工作处于被动状态。【拟解决的关键问题】通过染色镜检、雌虫会阴花纹形态观察及分子生物学方法对贵州主要烟区根结线虫种类进行鉴定，采用染色法和贝曼漏斗法对根结线虫发生规律进行调查，并使用烟草黑胫病菌（Phytophthora nicotianae）、根黑腐病菌（Thielaviop-sis basicola）和青枯病菌（Ralstonia solanacearum）特异引物对根结线虫感病样本进行检测，研究贵州主要烟区根结线虫种类分布、发生规律及其与烟草主要根茎类病害混合发生情况，为贵州抗根结线虫烟草品种选育、烟叶生产布局、根结线虫病综合防治策略制定等提供科学依据。

1材料与方法

1.1田间采样

2021年8月—2022年9月，于贵州省9个市（州）主产烟区进行病害调查和样本采集，使用五点取样法共采集98份疑似根结线虫病烟草根部样本，详情见表1。

1.2根结线虫的获取

分别采用直接解剖法和贝曼漏斗法（段玉玺，2011）获取根结线虫雌虫及2龄幼虫（J2）。

1.3根结线虫形态学鉴定

1.3.1根结线虫染色及镜检剪取采集的烟根样本，参考段玉玺（2011）的次氯酸钠—酸性品红染色法进行染色，染色后在显微镜下观察并拍照。

1.3.2雌虫会阴花纹标本制作及观察根结线虫雌虫会阴花纹标本制作及特征比对参考刘维志（2000）的方法，制作根结线虫雌虫会阴花纹玻片贴好标签于显微镜下观察拍照。

1.3.3 J2幼虫形态特征随机挑选20～30条J2幼虫，参照张绍升等（2021）的方法进行固定。固定后在显微镜下进行测量和观察，参考刘维志（2000）的描述进行特征比对。

1.4根结线虫分子生物学鉴定

1.4.1根结线虫样本总DNA提取使用FastDNA®Spin Kit for Soil（MP Biomedicals，美国）提取根结线虫样本总基因组DNA。具体操作：将样本剪成0.3～0.5 cm的根块，研磨后加入裂解研磨管E中；加入978μL磷酸钠缓冲液（SPB）和122μL MT缓冲液；置于涡旋仪上以6 m/s振荡40～50 s；14000 r/min离心10～15 min；将上清液移入1.5 mL离心管中，加入250μL蛋白沉淀溶液（PPS）并晃动混匀；14000 r/min离心5 min后将上清液转入15 mL离心管中，加入1.0 mL结合基质；颠倒2 min静置3 min沉淀；去除500μL上清液，结合基质与剩余上清液重悬，吸取约600μL混合液至吸附柱中，14000 r/min离心1 min；倒掉管中液体，重复上一步直至15 mL离心管中的上清液吸尽；在吸附柱中加入500μL SEWS-M溶液，14000 r/min离心1 min后弃管中的液体；14000 r/min离心2 min后换新的收集管并在室温下风干5 min；往吸附柱加入50μL DES溶液，14000 r/min离心1 min；弃吸附柱，DNA提取完毕。

1.4.2根结线虫种类分子生物学鉴定利用4对特异性引物（表2），对提取的根结线虫样本总DNA进行特异性序列扩增（SCAR）。PCR反应体系50.0μL：2×Taq PCR Master Mix 25.0μL，DNA模板1.0μL，正、反向引物各1.0μL，灭菌ddH2O 22.0μL。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃30 s，58～64℃30 s，72℃30～60 s，进行35个循环；72℃延伸7 min。取5.0μL PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，并在凝胶成像仪下观测拍照。

1.4.3烟草根结线虫样本中混合感染病原菌分子检测以提取的根结线虫样本总DNA为模板，采用特异性引物（表3）分别对烟草黑胫病菌、根黑腐病菌和青枯病菌进行PCR扩增。PCR反应体系同1.4.2。P1/P2、TB-5/TB-3和RSF/RSR扩增程序参考前人相关研究（梁元存等，2004；赵永强等，2009；Chen et al.，2010）。取5.0μL的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳并在凝胶成像仪下观测拍照。

1.5贵州烟草主产区根结线虫发生规律调查

从大田根结线虫初侵染期、生活史周期及土壤线虫数量变化规律3个方面进行烟草根结线虫发生规律调查。试验于2022年在毕节市大方县大水乡典型根结线虫病区（约0.133 ha）开展，试验地块按当地常规生产管理，不施用根结线虫防治药剂。自烟苗移栽后5～40 d，每5 d随机采集15株烤烟的根系样本，剪取20条左右须根组成混合样品，利用次氯酸钠—酸性品红染色法（段玉玺，2011）观察根内线虫及其虫态，确定J2初侵染期及生活史周期。栽后15 d起，采集根围土壤，用贝曼漏斗法（段玉玺，2011）分离J2，于显微镜下计数水中有口针的J2，统计每100 g土壤中的J2数量。

2结果与分析

2.1根结线虫染色结果

对98份疑似根结线虫病烟草根部样本进行彻底清洗，并进行拍照记录（图1）。随后进行染色处理，观察结果（图2）显示，有49份样本感染根结线虫，可清晰观察到紫色的梨形状雌虫、椭圆状的虫卵以及细长蠕虫状的J2。

2.2根结线虫种类鉴定

结合形态学与分子生物学特征，在感染根结线虫的49份样本中鉴定出3种根结线虫。（1）雌虫洋梨至柠檬形，头部有2～3个环纹。体长495～725µm，口针长14.5～17.5µm，背食道腺开口到口针基部球距离2～4µm（图3-I-A）。会阴花纹轮廓呈椭圆或近圆形，背纹紧密，背弓高且顶部圆润而扁平，偶尔呈梯形，两侧近直角；线纹平滑至波浪状，侧线不明显，有时分叉（图3-I-B）。J2体长335～415µm，口针长9.5～13µm，尾长38～55µm（图3-I-C）。形态学观察该种线虫疑似南方根结线虫，利用南方根结线虫特异性引物（Mi-F/Mi-R）对根结线虫样本总DNA进行扩增，得到了一条大小为1000bp的DNA条带（图3-I-D），表明所检测样本中线虫为南方根结线虫。（2）雌虫洋梨至球形，头部有1个环纹。体长510～9500µm，口针粗壮，锥部和杆部宽，背食道腺开口至口针基部球的距离4～6µm（图3-II-A）。会阴花纹轮廓扁平至圆形，背弓较低且线纹少有分叉，短而规则并在弓上成肩状突起，背线和侧线在侧线附近交叉，线虫1～2个翼（图3-II-B）。形态学观察该种线虫疑似花生根结线虫，利用花生根结线虫特异性引物（Far/Rar）对根结线虫样本总DNA进行扩增，得到一条大小约为420 bp的DNA条带（图3-II-D），表明所检测样本中线虫为花生根结线虫。（3）雌虫洋梨至近球形，有突出颈部，唇区有1个环纹，体长541～804µm（图3-III-A）。会阴花纹背弓圆而扁平，线纹平滑至波浪状，清晰侧线将花纹背线和腹线分开，分明显的背区和腹区（图3-III-B）；J2体长400～560µm，口针长9.4～11.4µm，尾长47～60µm（图3-III-C）。形态学观察该种线虫疑似爪哇根结线虫，利用爪哇根结线虫特异性引物（Fjav/Rjav）对根结线虫样本总DNA进行扩增，得到一条大小为720 bp的DNA条带（图3-III-D），表明所检测样本中线虫为爪哇根结线虫。

2.3烟草根结线虫种类及分布

49份感染根结线虫样本中，花生根结线虫和南方根结线虫单一侵染的样本分别有21和11份，分别占42.86%和22.45%；花生根结线虫与南方根结线虫、花生根结线虫与爪哇根结线虫混合侵染的样本分别有15和1份，分别占30.61%和2.04%（图4-A）；1份未检测出线虫，占2.04%。花生根结线虫为当前贵州烟草根结线虫的优势种群。

从根结线虫分布来看（图4-B），毕节市主要为花生根结线虫单一侵染和花生根结线虫与南方根结线虫混合侵染，少量南方根结线虫单一侵染，未见花生根结线虫与爪哇根结线虫混合侵染；安顺市和贵阳市为花生根结线虫单一侵染，未见南方根结线虫单一侵染、花生根结线虫与南方根结线虫混合侵染和花生根结线虫与爪哇根结线虫混合侵染；六盘水市主要为花生根结线虫单一侵染，少量南方根结线虫单一侵染，未见花生根结线虫与南方根结线虫混合侵染和花生根结线虫与爪哇根结线虫混合侵染；黔东南州和黔南州为南方根结线虫单一侵染及花生根结线虫与南方根结线虫混合侵染，未见花生根结线虫单一侵染和花生根结线虫与爪哇根结线虫混合侵染；黔西南州主要为花生根结线虫单一侵染，少量花生根结线虫与爪哇根结线虫混合侵染，未见南方根结线虫单一侵染和花生根结线虫与南方根结线虫混合侵染，一份未检测出线虫；铜仁市为南方根结线虫单一侵染和花生根结线虫与南方根结线虫混合侵染，未见花生根结线虫单一侵染和花生根结线虫与爪哇根结线虫混合侵染；遵义市主要为花生根结线虫与南方根结线虫混合侵染，少量南方根结线虫和花生根结线虫单一侵染，未见花生根结线虫与爪哇根结线虫混合侵染。

2.4根结线虫样本混合感染病原菌鉴定结果

分别采用特异性引物P1/P2、TB-5/TB-3和RSF/RSR对49份感染根结线虫样本中黑胫病菌、根黑腐病菌和青枯病菌进行PCR检测，结果（图5）共检测出2份样本感染烟草黑胫病菌、3份样本感染根黑腐病菌、10份样本感染青枯病菌，检出率分别为4.1%、6.1%和20.4%；表明3种病原菌与根结线虫存在混合侵染情况。其中青枯病菌与根结线虫混合侵染最普遍，在毕节市、遵义市、六盘水市、铜仁市和黔西南州烟草产区均有发生，黑胫病菌与根结线虫和根黑腐病菌与根结线虫混合侵染情况较少，黑胫病菌与根结线虫混合侵染主要发生在安顺市，而根黑腐病菌与根结线虫混合侵染主要发生在毕节市，并且这2种情况在铜仁市均有发生。

2.5贵州烟草主产区根结线虫发生规律调查结果

在栽后第5 d所采集的烟根样本经染色后未观察到J2，第10 d观察到J2，据此推测，春季该样点根结线虫初侵染期为栽后5～10 d内（图6-Ⅰ）;在栽后第15 d所采集的烟根样本中出现根瘤（图6-Ⅱ），第25 d及第35 d的样本经染色后分别可看到成熟雌虫和虫卵（图6-Ⅲ），至此完成一个约35 d的生活史周期。

从栽后15d起定期采集土样，在15～40 d内每5d用贝曼漏斗法计数根围土壤中J2数量变化。移栽后第15、20、25、30、35和40 d，每100 g根际土中J2数量分别为96、74、59、38、60和83条。土壤中J2数量在根结线虫侵染烟根后呈先减少后逐渐增加的变化趋势，推测因根结线虫侵染烟根并定居，致使土壤中的J2数量减少，而J2在烟根获取营养发育成雌虫并产卵，新孵化出的幼虫进入土壤开启下一个侵染周期，致使土壤中的J2数量上升。

3讨论

形态学鉴定作为根结线虫种类鉴定的经典手段之一，以雌虫会阴花纹的形态学特征观察为主，但雌虫会阴花纹存在一定种内变异（Coomans etal.，2012），单凭会阴花纹进行种类鉴定精确度不高。随着生物技术的发展，PCR技术中的SCAR技术凭借其引物长、退火温度高、稳定性高及快速准确的鉴定能力（杨艳梅等，2017）在烟草根结线虫种类鉴定中广泛应用。在对部分区域烟草根结线虫种类鉴定中，采样范围的局限可能会影响研究结果的准确性和普适性。本研究采用形态学与分子生物学相结合的方法对贵州烟区根结线虫进行种类鉴定和分布特征分析，采样范围涵盖贵州主要烟区，研究结果的准确性、可靠性及代表性较好。

本研究通过染色法推测烟草根结线虫在大田中的初侵染期为栽后5～10 d，其在根内的完整生活史周期约为35 d，与马文清（2017）的研究结果相似。此外，采用贝曼漏斗法调查土壤中根结线虫数量变化，发现土壤中J2数量在根结线虫侵染烟草根系后呈先减少后逐渐增加的趋势，与范成平等（2020）的研究结果相似。对烟草根结线虫大田初侵染期、根内生活史周期以及土壤中J2数量变化的了解，对准确预测烟草根结线虫病的发生具有重要意义，并为制定长期、有针对性的防治策略提供了科学依据。根据研究结果，可从烟草栽后第5 d起采取针对性措施对根结线虫进行防控，减少土壤中J2数量，以达到防控根结线虫病的目的。

贵州烟区存在花生根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫及花生根结线虫与南方根结线虫和爪哇根结线虫混合种群侵害，与何成兴等（2016）对西南地区根结线虫种类调查结果一致。本研究中毕节市主要是花生根结线虫单一侵染和花生根结线虫与南方根结线虫复合侵染，与李彩斌等（2021）报道毕节烟区根结线虫优势种类为南方根结线虫，其次为花生根结线虫的结果存在一定差异，可能是取样范围不同及长期种植抗南方根结线虫烟草品种导致南方根结线虫比例下降。当前花生根结线虫为贵州烟区的优势种群，并且多种群混合侵染现象日趋严重。烤烟品种K326对南方根结线虫1号和3号小种具有抗性；Speight G-28对南方根结线虫1号、3号生理小种和花生根结线虫1号生理小种具有抗性（喻盛甫等，1999；Ng’Ambi et al.，1999），但目前在贵州烤烟生产中均未种植，因此，迫切需要对抗花生根结线虫的烟草品种进行选育。此外，可借助现代育种技术、基因编辑等手段，培育出同时抗多种根结线虫侵染的烟草新品种，从而为烟草产业的可持续发展提供有力支持。受气候变化、土壤生态和种植结构调整等多重因素影响，烟草根结线虫优势种群会发生动态变化（崔江宽等，2021）。2013—2017年间，徐兴阳等（2013，2017）在云南省的研究发现，花生根结线虫替代南方根结线虫成为该区的优势种群。前人研究报道贵州省烟草根结线虫优势种群为南方根结线虫（莫熙礼等，2016；李彩斌等，2021），本研究结果表明，贵州省当前烟草根结线虫优势种群为花生根结线虫，说明根结线虫优势种群发生了变化，由南方根结线虫转变为花生根结线虫。这种种群动态波动可能是导致原有的根结线虫防治策略失效的原因，因此，及时更新根结线虫种类分布数据和持续监测其种群动态对于制定更为精准和有效的防治策略具有至关重要的作用。

土传性病害如黑胫病、根黑腐病和青枯病等常与根结线虫病混合发生，根结线虫造成的伤口为其他病原菌提供入侵机会，导致多种根茎类病害共同发生，加剧了烟株病害的复杂性和严重程度（Donget al.，2014；许大凤等，2018；白茂军等，2023；焦芹等，2024；王兴松等，2024）。林代福等（1998）研究表明，同时接种黑胫病菌和根结线虫较单接种黑胫病菌，烟株黑胫病发病加重，说明根结线虫的存在会加重黑胫病的发生。本研究结果表明，烟草黑胫病、根黑腐病和青枯病常与烟草根结线虫病和混合发生，因此，早期防治根结线虫病有利于减少烟草根茎类病害的发生。

4结论

当前危害贵州烟区的根结线虫种类有南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫，以花生根结线虫为优势种群；安顺市、贵阳市、毕节市、六盘水市和黔西南州烟草根结线虫主要种群为花生根结线虫，黔东南州、黔南州和铜仁市烟草根结线虫主要种群为南方根结线虫，遵义市主要烟草根结线虫种群为花生根结线虫与南方根结线虫混合种群；根结线虫初侵染期为栽后5～10 d，生活史周期约35 d，根围土壤中根结线虫J2数量随侵染时间的推移呈先减少后逐渐增加的变化趋势；根结线虫不同种群混合侵染，与青枯病、黑胫病及根黑腐病混合发生情况普遍。

参考文献（References）：

白茂军，高正锋，张力元，范成平，潘首慧，董延鑫，杨索，王莹，陈汶，杨小龙，岑浩，田玉琴，昝建朋，吴海.2023.烟草青枯病发病程度与土壤环境间的响应关系［J］.江苏农业学报，39（6）：1294-1302.［Bai M J，Gao Z F，Zhang LY，Fan C P，Pan S H，Dong Y X，Yang S，Wang Y，Chen W，Yang X L，Cen H，Tian Y Q，Zan J P，Wu H.2023.The relationship between the incidence of bacterial wilt disease and soil environment in tobacco［J］.Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，39（6）：1294-1302.］doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2023.06.004.

陈京环，石明明，乔万强，张洁，吴锦，李惠霞.2024.甘肃省黄芩根结线虫病病原种类鉴定［J］.植物保护，50（2）：202-210.［Chen J H，Shi M M，Qiao W Q，Zhang J，Wu J，Li H X.2024.Identification of pathogens of root-knot nematode disease of Scutellariabaicalensis in Gansu Province［J］.Plant Protection，50（2）：202-210.］doi：10.16688/j.zwbh.2023102.

陈昆圆，文艺，许相奎，周博，张红瑞，王铁霖，孟颢光，蒋士君，崔江宽.2022.河南省丹参根结线虫病原种类鉴定［J］.河南农业大学学报，56（6）：998-1006.［Chen KY，Wen Y，Xu X K，Zhou B，Zhang H R，Wang T L，Meng H G，Jiang S J，Cui J K.2022.Species identification of root-knot nematode pathogen on Salvia miltiorrhiza in Henan Province［J］.Journal of Henan Agricultural University，56（6）：998-1006.］doi：10.16445/j.cnki.1000-2340.20220906.001.

崔江宽，任豪豪，孟颢光，常栋，蒋士君.2021.我国烟草根结线虫病发生与防治研究进展［J］.植物病理学报，51（5）：663-682.［Cui J K，Ren H H，Meng H G，Chang D，Jiang S J.2021.Research progress on the occurrence and control of tobacco root knot nematode in China［J］.Acta Phyto-pathologica Sinica，51（5）：663-682.］doi：10.13926/j.cnki.apps.000487.

段玉玺.2011.植物线虫学［M］.北京：科学出版社.［Duan Y X.2011.Plant nematology［M］.Beijing：Science Press.］

范成平，代飞，李熙全，左锐，陈恩发.2020.烤烟井窖式移栽中“井窖”对烟草根结线虫数量的影响［J］.安徽农业科学，48（17）：164-166.［Fan C P，Dai F，Li X Q，Zuo R，Chen E F.2020.Effect of“Well Cellar”on the number of root knot nematodes in flue-cured tobacco well cellar trans-planting［J］.Journal of Anhui Agricultural Science，48（17）：164-166.］doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.17.042.

何成兴，王群，卢文洁，王艳青，李春花，吴文伟，黄月揖，马俊平，胡先奇，王莉花.2016.西南部分地区荞麦根结线虫种类与地理分布［J］.植物保护，42（3）：208-211.［He C X，Wang Q，Lu W J，Wang Y Q，Li C H，Wu W W，Huang Y Y，Ma J P，Hu X Q，Wang L H.2016.Geographical dis-tribution and species of root-knot nematodes on buckwheatin some areas of southwest China［J］.Plant Protection，42（3）：208-211.］doi：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.03.039.

江其朋，江连强，龚杰，余佳敏，杨橙，刘东阳，王金峰，陈树鸿，李石力，杜娟，丁伟，王勇.2021.影响四川凉山地区烟草根结线虫病发生的关键因子分析［J］.中国烟草学报，27（6）：89-98.［Jiang Q P，Jiang L Q，Gong J，Yu J M，Yang C，Liu D Y，Wang J F，Chen S H，Li S L，Du J，Ding W，Wang Y.2021.Exploring the key factors causing the outbreak of tobacco root-knot nematodes in Liangshan Pre-fecture of Sichuan Province［J］.Acta Tabacaria Sinica，27（6）：89-98.］doi：10.16472/j.chinatobacco.2021.067.

焦芹，张风文，郭丛，邓佳辉，姜兴印，王杰.2024.氟噻唑吡乙酮对烟草疫霉的室内毒力及对烟草黑胫病的防效研究［J］.植物保护，50（1）：328-333.［Jiao Q，Zhang F W，Guo C，Deng J H，Jiang X Y，Wang J.2024.Indoor toxicity of oxathiapiprolin against Phytophthora nicotiana and its con-trol effect against tobacco black shank［J］.Plant Protection，50（1）：328-333.］doi：10.16688/j.zwbh.2022722.

焦永吉，王闷灵，赵云波，赵世民，张涵，蒋士君.2014.河南省烟草根结线虫种类的PCR鉴定与种群分析［J］.中国烟草学报，20（3）：79-83.［Jiao Y J，Wang M L，Zhao Y B，Zhao S M，Zhang H，Jiang S J.2014.PCR-based identifi-cation of root-knot nematodes（Meloidogyne spp.）intobacco in Henan Province［J］.Acta Tabacaria Sinica，20（3）：79-83.］doi：10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.013.

李彩斌，彭宇，喻会平，刘琼，蔡志豪，李章海，黄衍章.2021.贵州省毕节烟区烟草根结线虫危害分布与种类调查［J］.湖北农业科学，60（S2）：257-261.［Li C B，Peng Y，Yu H P，Liu Q，Cai Z H，Li Z H，Huang Y Z.2021.Investigation of damage distribution and species of tobacco root-knot nematodes in tobacco area of Bijie prefecture of GuizhouProvince［J］.Hubei Agricultural Sciences，60（S2）：257-261.］doi：10.14088/j.cnki.issn.0439-8114.2021.S2.065.

梁元存，刘爱新，董汉松，王金生，张天宇.2004.寄生疫霉parA1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达［J］.微生物学报，44（2）：202-205.［Liang Y C，Liu A X，Dong H S，Wang J S，Zhang T Y.2004.Cloning of the ParA1 gene from phytophthora parasitica and its expression in Esche-richia coli［J］.Acta Microbiologica Sinica，44（2）：202-205.］doi：10.13343/j.cnki.wsxb.2004.02.016.

林代福，孙光军，夏永坤.1998.根结线虫与烟草黑胫病发生关系的研究［J］.云南农业大学学报，（1）：15-19.［Lin D F，Sun G J，Xia Y K.1998.Studies on the relationship between root-knot nematodes and black shank of tobacco［J］.Journal of Yunnan Agricultural University，（1）：15-19.］doi：10.16211/j.issn.1004-390x（n）.1998.01.004.

刘维志.2000.植物病原线虫学［M］.北京：中国农业出版社.［Liu W Z.2000.Plant pathogenic nematology［M］.Bei-jing：China Agricultural Press.］

陆惠光，陈恩发，范成平，左锐.2018.贵州安顺地区烟草根结线虫病发生动态与分布［J］.贵州农业科学，46（6）：76-79.［Lu H G，Chen E F，Fan C P，Zuo R.2018.Occurrence dynamics and distribution of root-knot nematode diseasein flue-cured tobacco in Anshun City，Guizhou［J］.Gui-zhou Agricultural Sciences，46（6）：76-79.］doi：10.3969/j.issn.1001-3601.2018.06.017.

马桂妹，谭涛，杨东，刘通，莫明和，王扬，姜方荣，张应和，赵华，刘剑金.2023.云南江城雪茄烟根结线虫病的病原鉴定及生物源氨气熏蒸的防治效果研究［J］.云南大学学报（自然科学版），45（1）：211-217.［Ma G M，Tan T，Yang D，Liu T，Mo M H，Wang Y，Jiang F R，Zhang Y H，Zhao H，Liu J J.2023.Pathogen identification of root-knot nematode disease in cigar tobacco in Jiangcheng，Yunnan and the control effect of ammonia fumigation of biological origin［J］.Journal of Yunnan University（Natural Sciences Edition），45（1）：211-217.］doi：10.7540/j.ynu.20220171.

马文清.2017.黔西南烟草根结线虫病调查研究［J］.现代农业科技，（8）：109-110.［Ma W Q.2017.Investigation of tobacco root knot nematode disease in QianxinanPrefec-ture［J］.Modern Agricultural Science and Technology，（8）：109-110.］doi：10.3969/j.issn.1007-5739.2017.08.070.

马云飞，许灵杰，李德仑，莫静静.2020.贵州烤烟与主要粮蔬作物的生产效率比较［J］.贵州农业科学，48（7）：18-22.［Ma Y F，Xu L J，Li D L，Mo J J.2020.Comparison of production efficiency between flue-cured tobacco and main grainamp;vegetable crops in Guizhou［J］.Guizhou Agricultural Sciences，48（7）：18-22.］doi：10.3969/j.issn.1001-3601.2020.07.005.

莫熙礼，武华文，黄蔚，吴彤林，赵同贵，邓伟.2016.黔西南州烟草根结线虫初步调查［J］.园艺与种苗，（3）：18-19.［Mo X L，Wu H W，Huang W，Wu T L，Zhao T G，Deng W.2016.Preliminary report on the Meloidogyne incognita of Qianxinan Prefecture［J］.Horticultureamp;Seed，（3）：18-19.］doi：10.16530/j.cnki.cn21-1574/s.2016.3.008.

王兴松，李恩星，杨诗瀚，杨媛，陈江政，李晗梅，王戈，王娜，白羽祥，周鹏，杜宇，李杰.2024.根结线虫病对烟草植株根际土壤微生物群落及其功能的影响［J］.江苏农业学报，40（6）：993-1003.［Wang X S，Li E X，Yang S H，Yang Y，Chen J Z，Li H M，Wang G，Wang N，Bai Y X，Zhou P，Du Y，Li J.2024.Effects of root-knot nematode disease onmicrobial community and function in rhizosphere soil of tobacco plants［J］.Jiangsu Journal of Agricultural Scien-ces，40（6）：993-1003.］doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.06.005.

许大凤，王文凤，朱启发，汪文杰，周本国，王芳，檀根甲.2018.安徽省烟草根黑腐病病原鉴定及生物学特性分析［J］.烟草科技，51（8）：27-34.［Xu D F，Wang W F，Zhu Q F，Wang W J，Zhou B G，Wang F，Tan G J.2018.Identifi-cation and biological characterization of Thielaviopsis basicola in Anhui Province［J］.Tobacco Scienceamp;Tech-nology，51（8）：27-34.］doi：10.16135/j.issn 1002-0861.2017.0471.

徐幸，卓富彦，杨芳，袁斌，彭云良，郭荣，姬红丽.2023.中国南方稻田及其周边环境根结线虫种类鉴定［J］.植物保护，49（6）：95-103.［Xu X，Zhuo F Y，Yang F，Yuan B，Peng Y L，Guo R，Ji H L.2023.Identification of root-knot nematode species from paddy fields and surrounding envi-ronment in southern China［J］.Plant Protection，49（6）：95-103.］doi：10.16688/j.zwbh.2022599.

徐兴阳，罗华元，饶智，杨明，端永明，杨应明，孙胜，周绍松.2013.昆明植烟土壤根结线虫种群动态研究［J］.昆明学院学报，35（6）：11-14.［Xu X Y，Luo H Y，Rao Z，Yang M，Duan Y M，Yang Y M，Sun S，Zhou S S.2013.Study on population dynamics of root-knot nematodes in tobacco-growing areas of Kunming［J］.Journal of Kunming Uni-versity，35（6）：11-14.］doi：10.14091/j.cnki.kmxyxb.2013.06.009.

徐兴阳，杨艳梅，端永明，胡先奇，张俊文.2017.昆明烤烟种植区根结线虫种类的初步鉴定［J］.云南农业大学学报（自然科学），32（5）：947-951.［Xu X Y，Yang Y M，Duan Y M，Hu X Q，Zhang J W.2017.Preliminary identification of the root-knot nematode from tobacco in kunming region［J］.Journal of Yunnan Agricultural University（Natural Science），32（5）：947-951.］doi：10.16211/j.issn.1004-390x（n）.2017.05.027.

杨艳梅，梁艳，袁绍杰，赵希城，胡先奇.2017.云南省部分烟区根结线虫形态和分子鉴定［J］.南方农业学报，48（2）：284-291.［Yang Y M，Liang Y，Yuan S J，Zhao X C，Hu X Q.2017.Morphology and molecular identification of root-knot nematode in partial tobacco growing areas in Yunnan［J］.Journal of Southern Agriculture，48（2）：284-291.］doi：10.3969/j：issn.2095-1191.2017.02.284.

喻盛甫，白万明，胡先奇，王扬.1999.烟草品种对常见根结线虫抗性鉴定的研究［J］.中国农业科学，32（5）：55-61.［Yu S F，Bai W M，Hu X Q，Wang Y.1999.Evaluation onresistance of tobacco cultivars to major Meloidogyne spp.［J］.Scientia Agricultura Sinica，32（5）：55-61.］doi：10.3321/j.issn：0578-1752.1999.05.009.

张绍升，刘国坤，肖顺.2021.植物线虫病害诊断与治理［M］.福州：福建科学技术出版社.［Zhang S S，Liu G K，Xiao S.2021.Diagnosis and management of plant nematode di-seases［M］.Fuzhou：Fujian Science and Technology Press.］

张宗锦，闫芳芳，孔垂旭，张映杰，杨鹏，倪荣清，王蓉，张海华.2019.烤烟菽麻间作对烟草根结线虫防效及烟叶产质量的影响［J］.中国烟草科学，40（2）：52-56.［Zhang Z J，Yan F F，Kong C X，Zhang Y J，Yang P，Ni R Q，Wang R，Zhang H H.2019.Effects of intercropping flue-cured tobacco with Crotalaria junceL.on the control of root-knot nematodes，yield and output of tobacco［J］.ChineseTobacco Science，40（2）：52-56.］doi：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.02.008.

赵永强，张成玲，张薇，李璐宁，张广民.2009.烟草根黑腐病菌的PCR分子检测［J］.植物病理学报，39（1）：23-29.［Zhao Y Q，Zhang C L，Zhang W，Li L N，Zhang G M.2009.Molecular detection of Thelaviopsisbasicola by PCR assay［J］.Acta Phytopathologica Sinica，39（1）：23-29.］doi：10.13926/j.cnki.apps.2009.01.003.

Blok V C，Phillips M S，Fargette M.1997.Comparison of sequences from the ribosomal dna intergenic region of meloidogynemayaguensis and other major tropical root-knot nematodes［J］.Journal of Nematology，29（1）：16.

Cao Y，Li C B，Ma G M，Ren Z，Lu N，Yang Z X，Yang X B，Mo M H.2023.First report of Meloidogyne arenaria infecting maize in Guizhou Province of China［J］.Plant Disease，107（10）：3321.doi：10.1094/PDIS-10-22-2420-PDN.

Chen Y，Zhang W Z，Liu X，Ma Z H，Li B，Allen C，Guo J H.2010.A real-time PCR assay for the quantitative detection of Ralstonia solanacearum in horticultural soil and planttissues［J］.Journal of Microbiology and Biotechnology，20（1）：193-201.doi：10.4014/jmb.0906.06019.

Coomans A，De Ley I T，Jimenez L A，Ley P.2012.Morpho-logical，molecular characterisation and phylogenetic posi-tion of Longidorusmindanaoensisn.sp.（Nematoda：Lon-gidoridae）from a Philippine Avicennia mangrove habitat［J］.Nematology，14（3）：285-307.doi：10.1163/156854111 X594974.

Dong K，Dean R A，Fortnum B A，Lewis S A.2001.Develop-ment of PCR primers to identity species of root-knot nema-todes：Meloidogyne arenaria，M.hapla，M.incognita and M.javanica［J］.Nematropica，31（2）：271-280.

Dong Y，Wang X Q，Xia Z Y，Xie G H，Wang Y，Xie Y，Cui H D.2014.Investigation on pathogenic factors of tobacco root-knot nematode disease in gengm county［J］.Agricul-turalScienceamp;Technology，15（12）：2253-2258.doi：10.16175/j.cnki.1009-4229.2014.12.046.

Elling A A.2013.Major emerging problems with minor Meloidogyne species［J］.Phytopathology，103（11）：1092-1102.doi：10.1094/PHYTO-01-13-0019-RVW.Ng’Ambi T B S，Rufty R C，Barker K R，Melton T A.1999.Identification of sources of resistance to four species of root-knot nematodes in tobacco［J］.Journal of Nemato-logy，31（3）：272-282.

Wang Y，Wang X Q，Xie Y，Dong Y，Hu X Q，Yang Z X.2015.First report of Meloidogyne enterolobii on hot pepper in China［J］.Plant Disease，99（4）：557.doi：10.1094/PDIS-08-14-0802-PDN.

Wu W T，Ye K H，Zhou S F，Guo L W，Zhu S S，Zhu Y Y，Wang Y，He X H.2023.Characterization of a root-knot nematode infecting Aconitum carmichaeliiDebx in South-west China［J］.Plant Disease，107（2）：272-275.doi：10.1094/PDIS-04-22-0953-SC.

Zijlstra C，Donkers-Venne T D，Fargette M.2000.Identification of Meloidogyne incognita，M.javanica and M.arenaria using sequence characterised amplified region（SCAR）based PCR assays［J］.Nematology，2（8）：847-853.

（责任编辑麻小燕）