槲皮素通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路抑制小鼠成纤维细胞焦亡

摘要：目的 探究槲皮素通过NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）/含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）/消皮素D（GSDMD）信号通路调控小鼠成纤维细胞（NIH-3T3）焦亡的影响及其机制。方法 实验分为对照（Control）组、模型（Model）组、槲皮素（HPS）组、NLRP3特异性抑制剂（MCC950）组。CCK-8法检测槲皮素对NIH-3T3细胞活力的影响。光镜下观察细胞形态变化，ELISA检测白细胞介素（IL）-18、IL-1β 含量，Western blotting 和qRT-PCR检测NLRP3、活化半胱氨酸蛋白酶 1（Cleaved caspase-1）、GSDMD-N蛋白表达及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA水平。TUNEL染色及乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测细胞焦亡情况。结果 槲皮素作用于NIH-3T3 细胞最佳干预浓度和时间分别是20 μmol/L和24 h。与Control组相比，Model 组细胞出现明显肿胀、破裂、细胞内容物流出，IL-18、IL-1β 含量和NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N蛋白表达及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA 水平均明显升高（Plt;0.001，Plt;0.0001），TUNEL 染色的阳性细胞数及LDH 释放量增加（Plt;0.0001）。与Model组相比，HPS组和MCC950组细胞焦亡情况改善，IL-18、IL-1β含量和NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N蛋白表达及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA水平显著降低（Plt;0.01，Plt;0.001），TUNEL染色阳性细胞数及LDH释放量明显减少（Plt;0.0001）。结论 槲皮素可能通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路抑制成纤维细胞焦亡，下调炎症因子释放从而发挥治疗作用。

关键词：槲皮素；细胞焦亡；NLRP3；成纤维细胞

慢性输卵管炎（CS）是妇科常见疾病，多因支原体、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌等病原体感染逆行至输卵管所致［1］。研究显示，育龄期妇女的发病率为0.6%～11%［2］。炎症长期刺激可导致输卵管组织纤维化，使其拾卵、运卵等功能受阻，进而诱发不孕。目前临床多用抗生素治疗，但副作用较大，炎症引起的纤维化病变亦无明显改善。因此，探索CS发病机制，寻找有效的治疗靶点具有重要意义。

细胞焦亡是一种促炎性细胞死亡［3， 4］，NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体是细胞焦亡的关键分子［5］，在呼吸、消化、免疫等多个系统的炎症性疾病中均被证实存在NLRP3 炎症小体的异常激活［6-8］。研究发现，NLRP3 炎症小体介导的经典焦亡途径在CS的发病机制中扮演重要角色［9］。输卵管炎性大鼠中存在NLRP3炎症小体活化，促使含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）剪切体形成，进而诱导消皮素D（GSDMD）裂解，引起细胞膜破裂，白细胞介素（IL）-18 和IL-1β 释放，加重CS 大鼠输卵管组织损伤［10， 11］。因此，通过调控NLRP3/Caspase-1/ GSDMD信号通路，可能是抑制CS细胞焦亡发生的关键环节。

课题组前期研究发现膈下逐瘀汤加减方治疗CS疗效显著［2， 12］，可有效改善患者输卵管通畅度、提高妊娠率，同时缓解CS大鼠输卵管肿胀、管壁增厚、盆腔粘连等炎症情况，降低IL-6、IL-8以及转化生长因子等的表达，抑制炎性损伤。目前中药复方疗效确切，槲皮素为其主要有效成分［13］，具有较好的抗炎功效，在多种炎症性疾病中应用广泛［14-16］。研究表明，槲皮素可通过抑制NLRP3 炎症小体激活减轻炎症反应，同时根据生物信息学分析发现，NLRP3可能是CS的关键调控因子［11］，但槲皮素是否通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD来改善CS，进而抑制输卵管纤维化的发生，目前尚未见报道。此外，对于CS的机制研究多集中在体内实验，缺乏有效的体外细胞实验验证。MCC950是一种特异性小分子抑制剂，可选择性阻断NLRP3炎症小体激活［17］。基于此，本实验选取小鼠成纤维细胞（NIH-3T3）为研究对象，采用脂多糖（LPS）联合三磷酸腺苷（ATP）诱导成纤维细胞焦亡模型，观察槲皮素处理后的变化，并与MCC950进行阳性对照，以揭示槲皮素调控CS的分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞

小鼠胚胎成纤维细胞（武汉梓杉生物）。

1.2 药品与试剂

LPS（上海语纯）；三磷酸腺苷（北京金克隆）；槲皮素（MCE）；MCC950（MCE）；DMEM高糖培养基、胎牛血清、青链霉素混合液（武汉塞维尔）；二甲基亚砜DMSO（BioFroxx）；胰酶消化液、磷酸盐缓冲液、无血清细胞冻存液、CCK-8试剂盒、通用型细胞组织固定液、逆转录试剂盒、qRT-qPCR试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、彩色快速凝胶配制试剂盒（北京赛文）；RIPA裂解液（上海碧云天），Trizol 试剂（Thermo）；小鼠IL-18、IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒（江莱生物）；GSDMDantibody N-terminal（ImmunoWay）；NLRP3 Antibody（武汉Proteintech），Cleaved caspase-1（Ala317） p10antibody（江苏Affinity Biosciences）、GAPDH antibody（上海爱必信）；HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（Immunoway）；一步法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天）；乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒（北京索莱宝）。

1.3 仪器

超微量分光光度计（Implen）；酶标仪（PerkinElmer）；荧光倒置显微镜（奥林巴斯）；数显恒温振荡器（江苏金坛吉特）；荧光定量Pcr仪（Roche），电子分析天平（OHAUS），电泳仪、半干转印电泳槽、凝胶成像仪（BIO-RAD）；离心机（Beckman Coulter）等。

1.4 细胞培养

NIH-3T3 细胞置于含有10%胎牛血清、0.5%青链霉素混合液的DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2的恒温箱内培养，隔日更换1 次培养基，待细胞生长密度于80%～90%时进行传代及后续实验操作。

1.5 细胞分组与处理

细胞分为4组：对照（Control）组，模型（Model）组，槲皮素（HPS）组，NLRP3 特异性抑制剂（MCC950）组。干预方法如下：Control组给予完全培养基培养；Model组采用1 μg/mL LPS联合5mmol/L ATP制备细胞焦亡模型；HPS组于LPS联合ATP诱导的焦亡模型前，根据“1.6CCK-8法检测槲皮素对细胞活力的影响”的实验结果，给予20 μmol/L的槲皮素预处理24 h；MCC950组在Model组的基础上给予1 μmol/L的NLRP3特异性抑制剂MCC950预处理1 h。

1.6 CCK-8法检测槲皮素对细胞活力的影响

将细胞计数后接种至96 孔培养板，细胞密度为3000（/ 100 μL·孔），依次设置0、5、10、20、40、80、160 μmol/L浓度的槲皮素处理细胞，每个浓度设置5 个复孔，培养24、48、72 h 后，每孔加入10 μL的CCK-8 溶液，恒温箱孵育2 h，酶标仪测450 nm处各孔的吸光度，并计算相对于对照组的细胞活性百分比。

1.7 细胞形态学观察

将NIH-3T3细胞接种至6孔板中（1×105/mL，2 mL/孔）。待细胞长满孔底后，给予“1.5细胞分组与处理”所述方法干预，处理结束后在光学显微镜下观察各组细胞形态，并于200倍数采集图像。

1.8 ELISA检测IL-18、IL-1β含量

将NIH-3T3细胞按照“1.5细胞分组与处理”所述方法处理后，采用EP管收集各组细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，待测样品及标准品均设置3个复孔，最后在酶标仪测定450 nm处的吸光值，根据公式计算出各组细胞上清液IL-18、IL-1β含量。

1.9 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测NIH-3T3 细胞内NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA表达

采用Trizol 法提取细胞RNA，通过分光光度计测定所提取RNA浓度及质量，根据逆转录试剂盒说明书将mRNA逆转录为cDNA，以此为模版，进行荧光定量PCR检测。反应程序如下：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45个循环。扩增结果采用2‐ΔΔCt法分析。实验所需引物均由安徽通用生物公司提供，引物序列：NLRP3，正向-GACCAGCCAGAGTGGAATGA，反向-CTTCAAGGCTGTCCTCCTGG；GSDMD，正向-AGTGCTCCAGAACCAGAACCG，反向-TCTGCCCTGAATGTTCCCATC；Caspase-1，正向-CTATGGACAAGGCACGGGAC，反向-TCAGCTGATGGAGCTGATTGA；β-actin，正向-AGCCATGTACGTAGCCATCCA，反向-TCTCCGGAGTCCATCACAATG。

1.10 Western blotting 检测NIH-3T3 细胞内NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N蛋白表达

各组细胞加入总蛋白提取试剂（RIPA裂解液+蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min，4 ℃条件下12 000 r/min离心5 min，取上清液。采用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。蛋白经100 ℃变性后上样，每孔20 μg，SDS⁃PAGE 凝胶电泳分离样品蛋白，转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂奶粉封闭2 h 后，加入一抗NLRP3（1∶ 1000）、Cleaved caspase-1（1∶ 1000）、GSDMD-N（1∶1000）、GAPDH（1∶10 000），4℃孵育过夜，TBST洗膜后加入Goat Anti-Rabbit IgG（1∶10 000），摇床室温孵育1 h。洗膜后经ECL化学发光剂显影，应用ImageJ软件计算条带的灰度值进行定量分析。

1.11 TUNEL染色检测细胞DNA损伤情况

各组细胞采用4%多聚甲醛固定30 min，清洗后加入含0.3% Triton X-100 的PBS，室温孵育5 min。每组样本加入50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min。PBS清洗，加入抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜200倍数下观察各组细胞染色情况并采集图像。

1.12 乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测细胞膜损伤情况

按照LDH活性检测试剂盒说明书操作，测定组、对照组和标准组均设置3 个复孔，配制相应溶液，混合均匀，室温放置3 min后在酶标仪450 nm下测定吸光度，根据公式计算出各组细胞上清液中LDH释放量。

1.13 统计学方法

采用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 9 软件统计分析，计量数据以均数±标准差表示，多组间比较应用单因素方差分析，以Plt;0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 槲皮素对NIH-3T3细胞活力的影响

将浓度0、5、10、20、40、80、160 μmol/L的槲皮素作用于NIH-3T3 细胞24、48、72 h 后。与0 μmol/L相比，除5、10 μmol/L外，槲皮素其余浓度处理细胞后，细胞活力呈现剂量和时间依赖性，即随着时间及药物浓度的增加，细胞活力逐渐降低。当药物浓度立 20 μmol/L，处理24 h，细胞活力最接近对照组，为减少药物干扰作用，故选此用于后续实验的干预条件（图1）。

2.2 细胞焦亡形态观察

与Control 组相比，Model 组、HPS 组、MCC950 组细胞形态均发生改变，Model组细胞肿胀、扩张较为明显，细胞膜出现破裂，胞质皱缩，泡状内容物流出，此为细胞焦亡的典型表现。HPS组和MCC950组细胞肿胀、破裂等情况呈现不同程度改善（图2）。

2.3 槲皮素对NIH-3T3细胞IL-18、IL-1β的影响

ELISA检测结果显示，与Control组相比，Model组细胞上清液中IL-18、IL-1β含量明显升高（Plt;0.0001）；与Model 组相比，HPS 组和MCC950 组的IL-18、IL-1β含量显著下降（Plt;0.0001，图3）。

2.4 槲皮素对NIH-3T3 细胞焦亡相关mRNA 水平的影响

qRT-PCR检测结果显示，与Control组相比，Model组细胞内NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA 水平显著升高（Plt;0.0001）；与Model组相比，HPS组和MCC950组的各mRNA水平均明显降低（Plt;0.0001，图4）。

2.5 槲皮素对NIH-3T3细胞焦亡相关蛋白表达的影响

Western blotting检测结果显示，与Control组相比，Model 组细胞中NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMDN的蛋白表达显著升高（Plt;0.001，Plt;0.0001）；与Model组相比，HPS组和MCC950组各蛋白表达降低（Plt;0.01，Plt;0.001，图5）。

2.6 TUNEL染色检测NIH-3T3细胞DNA损伤情况

TUNEL 染色检测结果显示，与Control 组相比，Model 组细胞阳性细胞明显增多。槲皮素和MCC950组阳性细胞数明显低于Model组（图6）。

2.7 LDH释放实验检测NIH-3T3细胞膜损伤情况

LDH释放实验结果显示，与Control组相比，Model组细胞上清液中LDH 含量明显升高（Plt;0.0001）；与Model 组相比，HPS 组和MCC950 组LDH含量均显著降低（Plt;0.0001，图7）。

3 讨论

成纤维细胞是炎症和纤维化的主要效应细胞［18］，慢性炎症的持续存在，刺激成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，分泌趋化因子、活性氧等，加重炎症反应，引起细胞外基质沉积，组织纤维化。抑制成纤维细胞激活可能是调控炎症、减轻纤维化的重要途径。在肺、肝、肾等器官的炎症性疾病中，NLRP3 炎症小体介导的细胞焦亡是引起组织炎症-纤维化病变的关键靶点［19-21］。本实验选用LPS联合ATP构建体外细胞焦亡模型，给予槲皮素干预，与MCC950进行对照，在细胞水平上探索CS的发病机制。

目前LPS联合ATP是体外细胞焦亡模型的常用方法［22， 23］。LPS作为细菌外壁的组成成分，可通过信号转导系统激活免疫细胞，释放多种炎性介质，诱发炎症反应。ATP是体内能量储存物质，亦是炎症反应重要内源性信号分子，与LPS联合可激活NLRP3炎症小体介导的经典焦亡途径。细胞经LPS联合ATP处理后，光学显微镜下可见其发生明显肿胀，部分细胞膜破裂，泡状内容物流出等形态改变，与Liu等［24］描述的形态相似。给予槲皮素和MCC950干预后，上述状况明显减轻。在细胞焦亡过程中，伴随着DNA 断裂和细胞膜穿孔［25］。TUNEL染色可检测DNA断裂以证明细胞损伤［26］，研究结果显示Model 组细胞TUNEL染色阳性细胞数明显高于HPS组和MCC950组。同时，LDH可通过孔隙释放到胞外，因而通过检测细胞上清液中LDH含量，可量化细胞膜损伤情况。经槲皮素和MCC950 处理后，LDH的释放量明显减少，间接证实细胞膜损伤情况较Model组少。相似的结果也发生在肺损伤和肠道损伤等的体外研究中，兰悦嘉等［27］采用LPS 联合ATP 处理THP-1 细胞，细胞焦亡率、LDH 释放量均显著增加。Zhang等［28］应用槲皮素干预LPS+ATP联合诱导的大鼠肠道微血管内皮细胞，结果显示细胞焦亡水平明显改善，与MCC950 的作用类似。上述结果表明LPS 联合ATP诱导成纤维细胞发生焦亡损伤，出现形态改变，而槲皮素可抑制这一作用。

NLRP3 是机体免疫和炎症反应的关键调节蛋白，经受外来病原体和内源性危险信号而激活，进而启动NLRP3 炎症小体（NLRP3-ASC-Caspase-1）组装。Caspase-1 是NLRP3 炎症小体的效应蛋白，活化前，以无活性的procaspase-1存在于胞内，通过炎症小体的组装，裂解为Cleaved caspase-1，之后将致炎因子前体pro-IL-18、pro-IL-1β剪切为成熟的IL-18、IL-1β［29-31］。另一方面，Cleaved caspase-1可识别并切割焦亡的关键执行蛋白——GSDMD特定位点，高亲和力的结合具有抑制性的GSDMD-C 结构域并释放GSDMD-N结构域［32］。后者附着于细胞膜，并发生寡聚化以形成焦亡孔，IL-1β和IL-18等胞内容物经焦亡孔流出，随后招募炎症细胞聚集，诱发炎症级联反应［33］。在CS 的研究中发现，NLRP3炎症小体的激活及其介导的经典细胞焦亡途径是重要调控靶点。刘梅等研究证实通过抑制NLRP3/Caspase-1细胞焦亡通路，可降低炎性因子的释放，进而减轻CS 炎症反应和组织损伤［10］。本研究结果显示，LPS 联合ATP 处理细胞后NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N的蛋白表达及NLRP3、Caspase-1、GSDMDmRNA水平明显上升，细胞上清液IL-18、IL-1β含量增加。槲皮素可逆转上述变化，表明槲皮素能够抑制成纤维细胞的炎性损伤和细胞焦亡。同时，采用MCC950对焦亡模型细胞进行干预，发现上述焦亡相关分子水平与槲皮素干预的结果相似。以上结果从分子水平上表明，槲皮素通过抑制NLRP3炎症小体的激活来抑制焦亡损伤。目前关于槲皮素通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路介导细胞焦亡在其他炎性细胞中已有证明，Luo等［34］采用槲皮素干预LPS+ATP诱导THP-1巨噬细胞焦亡模型，发现NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N、IL-1β等焦亡相关分子均明显下调，与本研究结果一致。Zhao等［28］研究发现槲皮素还可缓解乙醇诱导的肝细胞焦亡及NLRP3炎症小体的活化，说明槲皮素在不同疾病中通过抑制NLRP3炎症小体的激活，达到治疗疾病的目的。

综上所述，本研究发现NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路介导的细胞焦亡在CS的发病过程中具有重要作用，槲皮素可通过下调相关基因的表达，抑制细胞焦亡，减少促炎因子释放，降低输卵管炎症损伤，这为今后槲皮素治疗慢性输卵管炎提供了参考。

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（编辑：吴锦雅）