低聚果糖定量检测方法的研究进展

摘要低聚果糖（Fructooligosaccharide， FOS）具有调节肠道菌群、降低血糖等多种生理功能，作为一种功能性低聚糖广泛应用于食品和营养领域，常作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品及婴幼儿谷类辅助食品中。近年来，用于植物和食品中FOS 分离分析的技术得到了快速发展，然而FOS 的结构和组成多样性对其准确定量检测提出了挑战。建立FOS 的准确定量检测方法对于提升FOS 的质量、功效研究和相关食品质量的监管尤为必要。本文综述了近年来FOS 定量检测方法的研究进展，对当前FOS 定量检测方法存在的问题和面临的挑战进行了分析，并展望了其未来的发展方向。

关键词低聚果糖；益生元；膳食纤维；定量检测；食品基质；一测多评；评述

低聚果糖（Fructooligosaccharide， FOS）是由2～10 个单糖通过糖苷键形成的直链或支链聚合糖，是一种功能性低聚糖，被归类为益生元和可溶性膳食纤维。根据来源和糖单元之间连接键型， FOS 主要分为三大类型：菊粉型、Levan 型和混合型。菊粉型FOS 中果糖基之间为β（2→1）连接键，主要以菊粉为原料生产，菊粉经内切酶或外切酶酶解生成FOS，使用菊粉内切酶产生的FOS 包括蔗果型FOS（GFn）和果果型FOS（FFn）[1]；使用菊粉外切酶产生的FOS 只有GFn 型。另外，以蔗糖为底物，在果糖基转移酶作用下生产得到的FOS 也为GFn 型， GFn 型的末端通过α（1→2）键连接D-吡喃葡萄糖单元[2]。Levan 型FOS 中果糖基之间为β（2→6）连接键，末端可通过α（1→2）键连接葡萄糖单元，该类型FOS 主要是通过蔗糖：果聚糖6F-果糖基转移酶（6-SFT）用于蔗糖合成[3]，以[α-D-Glcp-（1→2）-β-D-Fruf-（2→6）-β-D-Fruf]为例，命名为异蔗果三糖[4]。由于不同植物中果糖基转移酶的表达活性不同，在自然界中还存在混合型FOS，混合型FOS 中同时具有β（2→1）键及β（2→6）键。除上述3 类FOS 外，菊粉新型FOS 和Levan 新型FOS 在文献中也有报道，其中，菊粉新型FOS 在植物中分布较广，其结构中包含两条基于β（2→1）连接键的果糖链，一条通过α（1→2）键连接葡萄糖单元，另一条通过α（2→6）键连接葡萄糖单元，以[β-D-Fruf-（2→6）-α-D-Glcp-（1→2）-β-D-Fruf]为例，命名为新蔗果三糖（neo-GF2）[5-6]。目前， FOS 商业市场由菊粉型FOS 主导，其中GFn 型FOS 居多，包括蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）和蔗果五糖（GF4）等[7-8]。不同类型FOS的分子结构见图1[9]。

FOS 存在于菊芋、菊苣、大蒜、雪莲果、香蕉等天然植物和蔬菜中[10-12]，其中菊芋、菊苣和雪莲果中的FOS 含量尤为丰富[13]。FOS 具有多种有益人体健康的生理功能。研究表明，食用FOS 有助于维持肠道菌群平衡，刺激双歧杆菌和乳酸杆菌的生长，提高免疫力，控制肥胖和骨质疏松症[14]。然而，也有研究指出过量摄入FOS 可能加剧肠易激综合症的症状[15-16]。我国国家标准《GB 14880—2012 食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》[17]中规定了菊苣来源的FOS 在婴幼儿配方食品以及婴幼儿谷类辅助食品中的添加量，其与低聚半乳糖、多聚果糖和棉子糖单独或混合使用的总量不得超过64.5 g/kg。2013 年10 月，新西兰食品安全部批准短链FOS 作为菊粉提取物替代品用于婴儿配方食品、婴儿食品和儿童辅食[18]。2022 年12 月30 日实施的我国国家标准《GB 1903.40—2022 食品安全国家标准食品营养强化剂低聚果糖》[19]对适用于食品营养强化剂的FOS 提出了质量要求。因此，建立FOS 的高准确度定量检测方法对于FOS的质量提升、功效研究和相关食品质量监管以及保障消费者安全具有重要意义。

目前， FOS 的检测方法主要有高效液相色谱法（High performance liquid chromatography， HPLC）、高效液相色谱-质谱联用法（High performance liquid chromatography-mass spectrometry， HPLC-MS）、高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器法（High performance anion exchange chromatography-pulsed ampere detector，HPAEC-PAD）和核磁共振波谱法（Nuclear magnetic resonance spectroscopy， NMR）等[20-23]。由于FOS 缺乏生色团，无紫外光吸收，多数不产生荧光，无法直接采用紫外或荧光检测器进行检测，因此，采用HPLC 法检测FOS 时常用的检测器主要为示差折光检测器（Refractive index detector， RID）、蒸发光散射检测器（Evaporative light scattering monitor， ELSD）和电雾式检测器（Charged aerosol detector， HPLC-CAD）。FOS定量检测策略可分为基于酶解法的间接定量分析法和基于FOS 单体标准品的直接定量分析法，相较于间接定量分析法，直接定量分析法具有更高的特异性和准确度，是未来发展的主要趋势。我国2021 年实施的国家标准《GB/T 23528.2—2021 低聚糖质量要求第二部分：低聚果糖》[20]采用FOS 单体标准品对FOS 进行直接定量检测，然而，由于FOS 结构的多样性及其相关单体标准品的匮乏，开发FOS 高准确度直接定量分析方法面临挑战。目前，有关FOS 定量检测方法的综述缺乏对近年来发展较快的分析技术（如HPLC-CAD 和NMR 等）的总结评述，并且未对FOS 定量检测方法发展方向以及面临的难题进行探讨[21-25]。本文总结了近十年来FOS 定量检测方法的研究进展，讨论了FOS 定量检测当前存在的问题和挑战，以期为后续FOS 的定量检测技术的发展提供参考。

1 FOS的定量检测

1.1 提取方法

目前， FOS 定量检测方法研究涉及的基体主要包括奶粉[26-31]、植物[32-37]、益生菌粉[38]以及饲料[39]等。FOS 的提取多采用水、乙腈、乙醇、氯仿或它们的混合物作为提取溶剂，不同基体中FOS 提取方法在提取时间、提取次数、提取温度以及提取溶剂的组成等方面有所不同。Li 等[40]将菊芋块茎样品研磨煮沸过滤，在滤液中加Ca（OH）2 去除蛋白质，再采用乙醇提取FOS，用于研究菊芋成长过程中FOS 聚合度（DP）的变化。为提高提取效率，也有研究者采用微波或超声技术辅助提取。张媛媛等[41]采用脱脂、热水超声提取和亚铁氰化钾-乙酸锌法沉淀蛋白的前处理流程提取奶粉和米粉样品中的FOS，回收率为95.20%～100.15%。对于不溶于水的样品基质，则是利用有机溶剂体系提取，如采用乙醇-水（60∶40， V/V）混合溶液提取牛蒡粉中的FOS[42]，经离心、过滤后检测，方法回收率为99.2%～102.6%。

1.2 定量检测策略

FOS 的定量检测策略可分为间接定量（酶解法）检测和直接定量检测两类。目前，有关FOS 定量检测的相关标准方法均采用间接定量策略，美国分析化学家协会1997 年实施的《AOAC 997.08 Fructans inFood Products Ion Exchange Chromatographic Method》[43]中采用酶解法检测食品中的果聚糖含量，首先采用沸水提取食品中的果聚糖，再向提取液中加入淀粉葡萄糖苷酶水解除去淀粉，然后加入菊粉酶将菊粉水解成葡萄糖和果糖，最后采用HPAEC-PAD 法测定初始提取液以及第一次水解液（淀粉水解）和第二次水解液（菊粉酶水解）中葡萄糖和果糖的含量，通过计算获得食品中的果聚糖含量。《AOAC 999.03Measurement of Total Fructan in Foods Enzymatic/Spectrophotometric Method》[44]也采用酶解法间接测定食品中的果聚糖含量，与前者不同的是，该方法将提取液中的蔗糖和淀粉酶解成还原糖，采用碱性硼氢化物将蔗糖和淀粉水解产生的还原糖还原为糖醇，再加入果聚糖酶将果聚糖水解为还原糖（葡萄糖和果糖），使用对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）法测定还原糖。我国于2017 年实施的《GB 5009.255—2016 食品安全国家标准食品中果聚糖的测定》[45]基于上述两种方法并进行了改进和简化，样品经热水浸提，其中的蔗糖经蔗糖酶水解成葡萄糖和果糖，经硼氢化钠还原生成相应的糖醇，样品的果聚糖经过果聚糖酶水解成果糖和葡萄糖，采用HPAEC-PAD 方法测定果糖含量，间接测得果聚糖的含量。间接法定量FOS 存在一些弊端，如无法准确测定基质中FOS 单体的含量、难以保证FOS 酶解或酸解完全以及容易受到其它糖干扰等。

直接定量法采用FOS 各单体标准品通过外标法对产品中的FOS 进行定量检测，是食品中FOS 定量检测的未来发展方向。我国于2022 年7 月1 日实施的《GB/T 23528.2—2021 低聚糖质量要求第二部分：低聚果糖》[20]推荐使用HPLC 法和HPAEC 法检测样品中FOS 单体的含量，通过加和得到准确的FOS 总含量。由于FOS 组成和结构高度多样化，相应单体标准品的分离纯化难度大、成本高，因此该标准提到在无法获得对应单体标准品时可使用对照品通过计算相对校正因子定量检测其它目标物。王智民等[46]在2006 年首次提出这种定量检测方法，也称为“一测多评”，已被用于药物分析领域。该方法的原理是选择一个性质稳定且易制备的成分作为内参物，在相应的线性范围内，研究内参物与其它待测成分在特定检测器上的响应关系，通过计算相对校正因子实现多个成分的同步测定。该方法适用于对照品制备难度大、成本高或对照品不稳定的多成分定量检测，为FOS的高效、高准确度定量检测开拓了思路。

1.3 定量检测方法

1.3.1 HPLC-RID法

RID 是连续检测样品流路与参比流路之间液体折光指数差值的检测器，基于试样成分与流动相的折射率的差别实现检测。目前， HPLC-RID 已广泛应用于糖类物质的检测，包括大蒜中的果聚糖[36]、牛奶中的乳糖和乳果糖[47]（乳果糖又名4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖，是由半乳糖和果糖组成的二糖，与乳糖互为同分异构体，不能被人体消化吸收，属于功能性糖）、植物和饲料中提取的多种糖单体和果聚糖[48]等。潘城[39]采用HPLC-RID 法对饲料中的FOS（GF2、GF3 和GF4）进行定量检测，采用Welch XB-NH2色谱柱分离，以乙腈-水（65∶35， V/V）为流动相进行等度洗脱， 3 种FOS 的仪器检出限为30.0～50.0 μg/g。Lima 等[49]采用HPLC-RID 法对葡萄酒和葡萄汁中的FOS（GF2 和GF3）进行定量检测，采用带有极性端基封尾的C18 色谱柱分离，以超纯水作为流动相， GF2 和GF3 的仪器检出限分别为90.0 和74.0 μg/mL。

由于RID 的稳定性受环境温度和流动相组成等因素的影响较大，梯度洗脱耐受性差， HPLC-RID 法常采用乙腈-水流动相体系等度洗脱分离FOS，目前主要应用于DP 为3～5 的FOS 的定量检测。

1.3.2 HPLC-ELSD法

ELSD 主要由雾化器、加热漂移管和散射池组成。液相色谱流出液经过雾化器和加热漂移管后，流动相挥发，而溶解在流动相中不易挥发的溶质形成颗粒物，这些颗粒物在气体的推动下进入光散射池，经光束散射后被检测器检测，产生电信号。由于产生光散射的仅为溶质颗粒，排除了流动相的干扰，相比于RID， ELSD 具有更好的梯度洗脱兼容性[50]，可同时分析更宽DP 范围的FOS。Cui 等[51]采用HPLC-ELSD法对巴戟天寡糖胶囊中的9 种菊粉型FOS（DP 为3～11）进行定量检测，使用Waters XBridgeAmide 柱梯度洗脱，在50 min 内实现了FOS 化合物的分离。该方法的仪器检出限为25.3～93.3 μg/mL， 定量限为42.0～144.7 μg/mL， 回收率为96.48%～100.84%。Hao 等[35]采用HPLC-ELSD 方法同时测定巴戟天中果糖、葡萄糖、蔗糖和10 种菊粉型FOS，使用Waters Acquity UPLC BEH Amide 色谱柱进行分离，以水（含0.1%氨水）和乙腈（含0.1%氨水）作为流动相进行梯度洗脱，在10 min 内实现了各化合物分离，仪器检出限为10.8～33.4 μg/mL， 定量限为35.9～124.8 μg/mL， 精密度（RSD lt; 4.76%）和准确度（回收率为98.59%～103.67%）高。综上，与HPLC-RID 相比， HPLC-ELSD 具有更高的灵敏度，并可设置梯度洗脱程序，实现DP 为3～15 的FOS 的分离和检测。此外， ELSD 作为一种通用型检测器，理论上其产生的响应只与化合物的质量有关，不同结构的化合物的响应因子较接近。基于此， Zhuang 等[32]利用HPLC-ELSD 建立了以GF4 为内参物的白术根茎中FOS（DP 为3～15）的定量检测方法，检测结果与采用各单体标准品的外标法定量检测结果的相对偏差小于13.76%。Zhou 等[52]建立了巴戟天中FOS 的一测多评方法，以GF3 为内参物，采用HPLC-ELSD 法对8 种FOS 单体进行了定量检测，并与外标法定量检测结果进行了比较，相对误差在‒0.58% ～ ‒0.20%之间。然而，上述研究中采用的FOS 单体标准品纯度较低，并且纯度量值缺乏溯源性，实验获得的相对校正因子的准确性有待考证。

1.3.3 HPLC-CAD法

CAD 的检测原理是样品溶液经雾化和干燥后与带电气体混合，通过静电检测计检测带电颗粒从而实现目标物的检测[53]。与ELSD 类似， CAD 也属于通用型检测器，产生的响应不依赖分析物的光谱或物理化学性质，在糖类物质的检测领域具有独特的应用优势，已用于多种糖类的定量检测，如蘑菇中的游离糖和糖醇[54]、饮料中的三氯蔗糖[55]和巴戟天中的GF3、GF4 和蔗果六糖（GF5）[56]等。Li 等[34]采用HPLC-CAD 法对白术和蒲公英等样品中DP 为3～13 的11 种FOS 进行定量检测，采用Waters XBridgeAmide 柱进行分离，以水和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，仪器检出限和定量限分别为0.4～0.6 μg/mL 和1.4～2.3 μg/mL， 回收率在94.0%～114.4%之间。Chen 等[37]也采用该方法定量检测了菊科、桔梗科和茜草科植物样品中DP 为3～13 的11 种FOS。与ELSD 相比， CAD 具有更高的灵敏度和更宽的动态范围，以及更优异的待测物响应一致性[57]。Liu 等[58]研究了不同化合物在CAD 检测器上的响应一致性，对于葡萄糖和果糖等糖类化合物，在进样相同质量目标物的条件下， CAD 响应差异仅为1%（图2），因此，HPLC-CAD 在FOS 一测多评方法开发中具有很大的应用前景，虽然目前文献报道中还未见基于HPLCCAD的FOS 一测多评方法，但在中药领域应用广泛。Wu 等[59]利用HPLC-CAD 建立的一测多评方法对芪参益气滴丸进行多组分定量检测，检测结果与外标法定量的检测结果的标准化均数差小于4.8%。

1.3.4 HPAEC-PAD法

PAD 是一种通过测量在适当的施加电位下电化学活性物质在工作电极表面发生氧化或还原反应时所产生的电流变化而对物质进行分析测定的检测技术，广泛应用于糖类检测领域[60]。常规的HPLC 法很难实现FOS 异构体的分离，特别是菊粉来源的FFn 型和GFn 型FOS 的混合物，但HPAEC-PAD 可进行FOS 异构体的高效分离分析。魏远安等[29]采用Thermo Fisher CarboPac PA20 色谱柱实现了菊粉来源FOS 中各组分（GFn 型、FFn 型和菊粉新型）的有效分离，并基于HPAEC-PAD 法对不同食品基质（糖浆、糖粉原料样品、含蛋白质和脂肪等样品）中的FOS（GF2、neo-GF2、GF3 和GF4）进行定量检测，方法检出限在0.13～0.41 μg/g 之间。Pohnl 等[33]分别采用HPAEC-PAD 和HPLC-ELSD 检测洋葱中的FOS，结果表明， HPAEC-PAD 法的仪器检出限为0.038～0.76 μg/mL， HPLC-ELSD 法的仪器检出限为11.24～22.54 μg/mL。综上， HPAEC-PAD 不仅能实现FOS 异构体的分离，并且具有更高的灵敏度。此外，HPAEC-PAD 方法采用水溶液体系作为流动相，无需考虑高DP FOS 的溶解度问题，但采用HPAEC-PAD方法时，各化合物之间的响应系数差别较大，因此采用HPAEC-PAD 对FOS 进行直接定量检测的前提是具有各FOS 单体标准品。

1.3.5 LC-MS法

MS 利用化合物电离产生的特征离子对化合物进行定性和定量检测，具有高灵敏度及高选择性[61]。目前，应用于FOS检测的质谱仪主要有三重四极杆质谱仪（Triple quadrupole mass spectrometer， QQQ-MS）[62]、单四极质谱仪（Single quadrupole mass spectrometer， Q-MS）和飞行时间质谱仪（Time-of-flight mass spectrometer，TOF-MS）[63]等。甄振鹏等[64]采用HPLC-MS/MS 建立了乳粉中FOS（GF2、GF3、GF4 和GF5）的定量检测方法，乳粉样品经乙醇-水提取后，采用XBridge Amide 柱在35 min 内实现了各化合物的分离，使用电喷雾离子源在负离子模式下采用多反应监测（MRM）模式对FOS 各单体进行定量检测。该方法回收率为90.8%～95.8%，精密度（RSD）lt;9%，方法检出限和定量限分别为0.022～0.054 μg/g 和0.073～0.18 μg/g。刘芸等[30]采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（HPLC-Q/Orbitrap HRMS）建立了奶粉中FOS（GF2、GF3 和GF4）的定量检测方法，采用Agilent Carbohydrate 色谱柱在10 min 内实现了各化合物的分离，使用电喷雾离子源在正离子模式下采用MRM 模式对FOS 各单体进行定量检测，方法检出限为0.055～0.100 μg/g。LC-MS 法分析FOS 具有较高的灵敏度，同时LC-MS 法可利用特征离子对FOS 进行定性分析。目前， LC-MS 法分析FOS 的难点在于FOS 异构体的分离和准确定量检测。研究FOS 异构体的质谱裂解机理、剖析不同FOS 单体的特征离子碎片将有助于推进LC-MS 法在FOS 异构体分析中的应用。LC-MS 法既可实现糖类异构体的分离，又能对化合物进行定性鉴别，在糖的分离分析方面具有良好的应用前景。

1.3.6 NMR法

NMR 具有无损、快速以及样品无需分离纯化等优点，早期在糖类物质研究领域的应用主要为糖异构形式、环结构和糖苷键连接方式等的结构解析[65]。近年有研究者采用NMR 对糖类物质进行定量检测。核磁共振氢谱（1H NMR）的灵敏度远高于核磁共振碳谱（13C NMR），因此1H NMR 更常用于糖类物质的定量检测，如测定食品中的水苏糖及单双糖等[66-67]。陈新启等[68]以蔗糖为内标，氘代水为溶剂，采用1H NMR 测定蔗果七糖（GF6）、蔗果八糖（GF7）和蔗果九糖（GF8）原料的纯度，方法检出限为22.2～26.4 μg/mL。1H NMR 方法作为一种绝对定量方法，无需对样品进行分离纯化，仅需选择常见标准品作为内标即可实现对目标物的定量检测，但其灵敏度较低。采用NMR 对复杂基质中的FOS 进行定量检测时需对目标物特征峰进行精准确证，对实验人员的NMR 谱图解析能力要求较高。另外， NMR 仪器价格昂贵，维护成本高，目前主要应用于前沿科学研究。

1.3.7 其它定量检测方法

除上述方法外，研究者还开发了一些简单快速、检测成本低的FOS 检测方法，如薄层色谱法（TLC）和红外光谱法（FTIR）等[69-71]。Marquez 等[72]开发了一种TLC 联合图像分析法对食品中的FOS 进行检测，根据斑点面积和浓度的关系实现半定量检测，方法检出限低于200 μg/mL。Cassani 等[73]开发了一种基于FTIR 测定FOS 的方法，与多变量分析相结合，可同时定量分析DP 为3 和5 的FOS。但是，这两种方法灵敏度低，并且为半定量方法，难以实现FOS 的高准确度定量检测。

2 结论与展望

FOS 在食品及营养领域有非常广阔的应用前景，我国也发布了相关的产品标准以促进FOS 相关产品质量提升，但是FOS 精准定量检测方法发展相对滞后。目前， FOS 的定量分析策略已从酶法间接定量检测逐渐发展到基于高纯单体标准品的高准确度直接定量检测。然而，由于缺乏相关单体标准品，目前FOS 直接定量分析法的单体覆盖度低，大部分集中在GF2、GF3 和GF4 的定量检测；另外，现有的单体标准品纯度量值缺乏溯源性，难以保证FOS 定量检测的准确度。在未来的FOS 定量检测方法研究中，一方面，需开发高准确度纯度定值方法，研制具有量值溯源性的FOS 单体标准物质，为FOS 准确定量溯源提供物质基础；另一方面，开发高准确度一测多评方法可解决因标准品不易获得而产生的定量分析难题。

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