兰科植物共生真菌研究进展

杨文宏 黄杏娥 王玲 郭承刚 汤王外 和寿星

摘要 兰科植物种子体积微小且无胚乳，数量巨大，通常一颗蒴果内有上万粒种子。自然状态下兰科植物种子萌发所需的营养只有依赖共生真菌菌丝侵入才能获得，因此高度依赖于共生真菌。兰科共生真菌促进兰花原球茎、幼苗生长发育、帮助根系吸收水分和营养物质。从国内外兰科植物共生真菌的分离鉴定、种类、多样性和专一性、共生萌发以及应用前景等方面进行综述，进一步为研究兰科植物种子萌发、野生资源的保护与利用、选育新品种、兰花种植产业化以及次生代谢药物研发提供理论依据和参考。

关键词 兰科植物；共生真菌；多样性和专一性；种子萌发

中图分类号 S 682.31  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）12-0025-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.12.006

Research Progress of Symbiotic Fungi in Orchidaceae

YANG Wen-hong，HUANG Xing-e，WANG Ling et al

（Institute of Alpine Economic and Botany，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Lijiang，Yunnan 674199）

Abstract Orchidaceae are small in size and have no endosperm.Usually，there are tens of thousands of seeds in a capsule.The nutrients required for the germination of orchid seeds in the natural state can only be obtained by relying on the invasion of symbiotic fungal hyphae，so they are highly dependent on symbiotic fungi.Orchidaceae symbiotic fungi promote the growth and development of orchid protocorm and seedlings，and help roots absorb water and nutrients.This paper reviews the isolation and identification，species，diversity and specificity，symbiotic germination and application prospects of symbiotic fungi in orchids at home and abroad，which will further provide theoretical basis and reference for the study of orchid seed germination，protection and utilization of wild resources，breeding of new varieties，industrialization of orchid planting and development of secondary metabolic drugs.

Key words Orchidaceae;Symbiotic fungi;Diversity and specificity;Seed germination

基金项目 云南省科技厅基础研究计划项目（202101BC070003）； 云南省财政厅项目（530000210000000017045）。

作者简介 杨文宏（1987—），男，云南丽江人，助理研究员，硕士，从事花卉资源及遗传育种研究。*通信作者，副研究员，从事兰花品种选育研究。

收稿日期 2023-08-31

兰科植物是被子植物最大的科之一，全球约有兰科植物899属27 801种，其分布于大部分陆生生态系统，热带及亚热带雨林是其主要分布地区，温带地区也常有分布；兰科植物花型优美、花色丰富、花香怡人，具有极高的观赏价值，此外，部分兰科植物还是传统中药，具有较高的药用价值［1］。兰科植物种子体积微小且无胚乳，数量巨大，通常一颗蒴果内有上万粒种子［2］。自然状态下兰科植物种子萌发所需的营养只有依赖共生在菌丝侵入才能获得，以及兰科植物正常生长、开花结果等的过程大部分都有真菌参与共生，因此兰科植物是与真菌形成共生关系的植物［3-4］，而共生真菌泛指生活或特定阶段生活在植物组织内并对该植物组织不造成明显病害的微生物，包括菌根菌与潜伏性病原菌［5］。自从兰花种子促萌发真菌发现以来，国内外学者在对兰科种子促萌发真菌的分离筛选、特异性、共生机制研究等方面做了大量研究，对保护和利用兰科资源发挥了重要作用。该研究从国内外兰科植物共生真菌的分离鉴定、共生真菌种类、共生真菌多样性和专一性以及共生萌发等方面进行综述，旨在进一步为研究兰科植物种子萌发、野生资源的保护与利用、选育新品种以及兰花种植产业化研发提供理论依据和参考。

1 共生真菌的分离及鉴定

1.1 共生真菌分离

兰科植物是与真菌共生的植物，根据兰科共生真菌研究方法的发展历程，结合鉴定结果的准确性与高效性，其研究方法主要分成传统研究法和分子生物学方法。传统研究法包含单菌丝团分离法、原生境种子诱捕技术和实验室播种诱捕技术。单菌丝团分离法是指经过表面消毒后，组织块细胞中菌丝团得到分离，利用显微镜选取独立菌丝团并接种在培养基表面，适宜温度、光照条件下培养并观察，如伍建榕等［6］利用该方法从云南怒江、保山、大理等兰花主要分布区兰花植株根部分离得到184个真菌菌株；袁莉杭等［7］从野生春兰（Cymbidium goeringii）菌根共分离到6株真菌菌株；宋新月等［8］从云南和广西两地的竹叶兰根、茎及叶片等部位中共分离出16株内生真菌。原生境种子诱捕技术是指装袋后的兰科植物种子放置回兰科植物生长的环境中进行萌发试验，然后再从原球茎中分离内生菌［9］；姜昊颖［10］利用原生境种子诱捕技术，获得了大量华石斛的原球茎，并初步得到自然状态下其种子萌发所得原球茎数量极低，原生境人工播种显著提高原球茎的萌发数的规律；孙晓颖等［11］在带叶兜兰生境内采用原地共生萌发技术，获得了2株自然萌发的小幼苗，并分离出有效的种子萌发共生菌。实验室播种诱捕技术是指在实验室条件下将原生境中枯枝落叶、土壤等作为种子萌发环境进行萌发试验，通过分离纯化得到原生环境中帮助种子萌发的真菌。此技术不仅有效将萌发真菌进行分离，而且研究兰科植物种子共生萌发更加方便简洁［12］。

1.2 共生真菌鉴定

共生真菌分离出来后要对其进行鉴定，主要有形态学和分子生物学两种鉴定方法。形态学鉴定就是利用显微镜观察菌丝和菌落的形态特征、细胞核计数以及菌丝隔膜超微结构。20世纪80年代末，Moore［13］通过菌丝隔膜超微结构观察，得到了兰科共生丝核菌属以外的角菌根菌属（Ceratorhiza）、念珠菌根菌属（Moniliopsis）、瘤菌根菌属（Epulorhiza）3个新属；Senthilkumar等［14］报道，兰科菌根复杂菌丝结构可以用丫啶橙为染料进行荧光显微照相并且效果很好；Meloille等［15］利用多种荧光染料结合激光扫描共聚焦显微技术在熊果苷和兰花中得到菌根结构的三维图像。伍建榕等［6］从兰花根中分离到的真菌，根据菌丝特征、菌落形态、产孢结构以及孢子形态等分为18类，分别属于木霉属、丝核菌属、团丝核菌属、毛壳菌属、束格孢属、镰刀菌属、枝顶孢属、兰科丝核菌类、丝孢纲的其他属等。颜容等［16］通过对独花兰菌根分离以及观察菌根的基本结构，获得属于担子菌和有丝孢菌在内的共36个菌株，镰刀菌属为优势种属；胡陶等［17］对5种中国兰属植物共生真菌分离、观察其菌丝隔膜超微结构，最终将得到的共生真菌归类到无性态的瘤菌根菌属真菌。

形态学鉴定的方法很难将内生真菌鉴定到种水平，容易造成鉴定结果不准确。因此得借助分子生物学技术来实现鉴定结果的准确性，随着分子生物学的发展，多种分子标记技术以及rDNA序列分析越来越广泛地运用于菌根真菌鉴定和比较。Shan［18］由香港不同点的4种陆生兰科植物根中分离得到21个丝核菌样菌株；通过菌丝细胞核数、培养形态、隔孔超微结构和rDNA片段的RAPD分析表明，这些菌株大多与角担菌属和胶膜菌属相关。李潞滨等［19］利用rDNA-ITS技术对4种不同地理分布和生态型中国兰属植物进行分离，得到12株共生瘤菌根菌（Epulorhiza）。董芳［20］对野生春兰根部分离到的8种菌株及实验室保藏的9个菌株利用rDNA-ITS技术进行鉴定，分别隶属镰孢属、毛壳菌属、角菌根菌属、曲霉属、伞状霉属、丝葚霉属、交链孢属、青霉属、束丝菌属9个属。田凡等［21］将硬叶兜兰菌根中分离到的29株菌根真菌进行rDNA-ITS序列分析共鉴定出23个属，为瘤菌根菌属、栓菌属、胶膜菌属、小脆柄菇属、附毛菌属、丝核菌属、镰刀菌属、拟迷孔菌属、毛壳属、拟层孔菌属、侧耳属、弯孢聚壳属、轮枝菌属等，然而分离得到的菌株大部分都属于胶膜菌属和瘤菌根菌属。冯晓晓等［22］从盆距兰（Gastrochilus calceolaris）、贝母兰（Coelogyne cristata）、隔距兰（Cleisostoma linearilobatum）、毛兰（Eria）和万代兰（Vanda）的根、茎、叶分离得到172株内生真菌，用rDNA-ITS技术鉴定为盘菌亚门的4纲11目29属，以肉座菌目、炭角菌目和格孢腔菌目真菌的相对频率较高。

2 共生真菌的多样性及专一性

通过形态学与分子生物学的鉴定，兰科植物内生真菌尤其是菌根真菌最为丰富多样，如胡陶［23］对兰属植物菌根真菌AFLP聚类分析发现，兰属植物菌根真菌的多样性同时受种类、生境和生态类型3个方面因素的影响，云南地区附生兰中分离的菌株多样性最低，受生境因素和生态类型因素的影响最大，地生类型的春兰分离所得的菌根真菌也表现出较低的多样性；不同类别的兰科植物处在不同生长时期过程中所需的菌根真菌也是不相同的，如侯天文等［24］在研究四川黄龙沟地区兰科菌根真菌多样性时，观察到兰科植物生长季节与菌根真菌的多样性变化密切相关。缪福俊等［25］对生长在迪庆州的5种杓兰属植物共生真菌进行多样性分析，结果显示菌根真菌在杓兰属植物中具有很高的多样性，rDNA ITS序列克隆数量多达388个。研究表明，兰科植物菌根真菌中角担菌科和胶膜菌科真菌是其中的优势种群，绝大多数兰科植物共生萌发真菌都属于丝核菌类真菌，然而这类兰科植物的生活型主要为附生和地生型［26］。

Curtis［27］较早地对兰科植物共生菌根真菌专一性进行研究，结果表明从生长在北美不同地区的兰科植物菌根真菌分离中得到同一或相近地区的兰科植物中具有相同的菌根真菌。Masuhara等［28］提出，兰科植物能与特定真菌形成菌根的条件是在相同原生环境下。共生真菌具有专一性，不同类型的共生真菌参与种子萌发的不同生长阶段［29］，在野生状态下大多数兰科植物种子的萌发均需特定的真菌参与［30］，如角担菌科多为小斑叶兰（Goodyera repens）种子的共生真菌，丝核菌属多为绶草（Spiranthes sinensis）种子和山兰（Oreorchis patens）根系的共生真菌［31-33］。蜡壳菌属、胶膜菌属以及角担菌属是现阶段能够与兰科植物形成共生关系的菌根真菌［34］。

3 兰科植物种子共生萌发

兰科植物种子与萌发菌共同培养，实现其种子萌发的方式称为共生萌发，20世纪初Bernard最先展开了真菌和兰花种子萌发关系的研究，其利用纯化的真菌侵染种子后萌发状况良好且能够形成幼苗。同时其明确指明，在自然条件下，兰花种子只有被适合的真菌侵染后才能成功萌发［20］。20世纪80年代末徐锦堂等通过天麻（Gastrodia elata）种子的培养，在原球茎中共分离到12种萌发真菌可供天麻种子生长萌发，其中紫萁小菇（Mycena osmundicola）为代表的菌株效果最好［35］。郭顺星等［36］采用种子伴菌播种方法，观察记录得到铁皮石斛（Dendrobium officinale）种子萌发率达64％，罗河石斛（D.lohohense）种子萌发率达20％，而无伴菌播种的无种子萌发。共生菌兰小菇是墨兰（Cymbidium sinense）菌根分离得到，通过其侵染叶片获得菌叶来充当培养天麻、石斛等12种兰科药用和观赏植物的种子培养基，结果显示该真菌有助于提高天麻、报春石斛（D.primulinum）、密花石斛（D.densiflorum）、鼓槌石斛（D.chrysotoxum）、长苏石斛（D.brymerianum）萌发率，而不能够促进墨兰种子的萌发［37］。杨友联等［38］通过分离获得独蒜兰（Pleione bulbocodioides）菌根真菌并将其与种子进行共生培养发现，GN21、GN23和GN24等3种菌株能有效促进种子萌发，而有GN21菌株共生的种子萌发率最高且显著高于对照组；同时发现相同兰科植物中分离出不同的菌根真菌绝大多数属于同一个属，它们当中一部分对种子萌发有显著的促进作用，一部分没有促进作用，相反会使原球茎产生病斑甚至使其死亡。郭仕坛等［39］将2种春兰和墨兰根部分离到的菌根真菌CLB111、MLX102与其大雪兰（C.mastersii）种子共生萌发，结果表明对其种子有明显的促进作用，萌发率与对照均达到极显著差异。

4 兰科植物共生真菌的应用前景

兰科植物种子必需营养物质含量较低，内部物质获取的机会少、效率低，还需要在共生真菌的异养影响下萌发［40］；除此之外，兰科共生真菌促进兰花原球茎、幼苗生长发育；与兰花根系共生提供水分和多种营养物质并促进生长开花；增强植株抗病能力抑制病原菌的生长，并帮助植物抵御病害；共生真菌可以改善土壤质量和结构形成土壤菌根，增加土壤的保水性和通气性，提高土壤的肥力从而提升兰科植物生长环境［5］。因此，共生真菌可以广泛应用到兰科植物的育种、繁育、种植和兰花产业化、规模化发展中。兰科植物不仅极具观赏价值而且药用价值也极为丰富，兰科植物共生真菌可产生多种生物活性物质，具有潜在的药物开发价值和前景，有研究报道，霍山石斛内生菌次生代谢产物丰富多样，包含黄酮、生物碱、氨基酸、环二肽、核苷酸、降甾醇类化合物，具有抑制肿瘤生长、有促进细胞凋亡和抑制毒素活性等作用［41］；此外，天麻内生菌在蜜环菌的混菌体系中次生代谢产物主要为蒽醌类化合物，此类化合物具有抗癌、抗菌、抗病毒、抑制中枢神经和cAMP磷酸二酯酶等生物活性［42-43］。

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