不同消毒条件对白术种子萌发的影响研究

刘小丽+朱梦晴+许楠等

摘 要：以白术（Atractylodes macrocephala）种子为实验材料，研究了不同消毒条件对白术种子萌发的影响。结果表明：随着NaClO浓度的增加，杀菌效果越来越好，但发芽率却越来越低。就本实验而言，先把白术种子在流水下冲2h，剥去种皮，再在流水下冲1h，之后用75%的酒精浸泡30s，最后用10%的NaClO溶液浸泡15min，效果最好。对于白术幼苗生长的影响，还有待于进一步的研究和总结。

关键词：白术；种子萌发；NaClO溶液

中图分类号 Q947.8 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）19-22-04

Influence of Different Sterilization Conditions on Atractylodes macrocephala Seed Germination

Liu Xiaoli1，2 et al.

（1School of Life Sciences，Fuyang Normal University，Fuyang 236041，China；2Engineering Technology Research Center of Anti-aging Chinese Herbal Medicine，Fuyang 236041，China）

Abstract：Taking Atractylodes macrocephala seeds as experimental materials，the thesis studied the effects of different sterilization conditions on germination of Atractylodes macrocephala seeds. The experimental results show that：with the increasing of NaClO concentration，bactericidal effect is better，but the germination rate is lower. Therefore，in this experiment，firstly rinse the Atractylodes macrocephala seeds under running water for 2 hours，stripped off the seed coat，and then rinse them under running water for another 1 hour，then soak for 30 seconds with 75% alcohol，immersed in 10% NaClO solution for 15 mins，In this case，the effect is the best.The influence on Atractylodes macrocephala seedlings growth still needs further study and conclusion.

Key words：Atractylodes macrocephala；Seed germination；NaClO solution

白术（Atractylodes macrocephala）是菊科苍术属药用植物，具有燥湿利水、健脾益气、止汗安胎之效[1]，同时还具有抗衰老、抗肿瘤、抗炎抗菌等药用作用[2]，有效成分主要是白术多糖、白术内酯、挥发性成分以及白术氨基酸[2]。由于其具有很高的药用价值和经济价值，目前对于白术的高产栽培技术[3]及茎尖组织培养和快繁技术优化[4]已有研究。

1 材料与方法

1.1 材料 白术种子，2012年采于亳州。经适度的晾晒，选取饱满的种子作为实验材料。

1.2 试剂

1.2.1 实验试剂 自来水，蒸馏水，无菌水，NaClO溶液（浓度分别为1%、6%、8%、10%、12%、14%），75%的酒精。

1.2.2 MS培养基的配制 （1）配制好MS培养基的4种母液：母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ，母液Ⅳ。（2）配制400mLMS培养基需要：母液Ⅰ20mL，母液Ⅱ、母液Ⅲ、母液Ⅳ各2mL，琼脂3.2g，蔗糖12g，然后加蒸馏水定容至400mL，调节pH为6.0。

1.3 主要实验仪器 生化培养箱（ZSD-A1270）、恒温振荡器（ZHWY-100B）、电子精密天平（FAI604N）、数码恒温水浴锅（HH-2）、电热恒温鼓风干燥箱（XMTD-8222）、海尔低温保存箱（DW-401262）、超净工作台、高压灭菌锅、移液枪以及其他常规实验用具。

1.4 实验方法

1.4.1 高压灭菌处理 将待用的烧杯，培养瓶，配置好的MS培养基以及其他待用的可以灭菌的东西用报纸包好，放入高压灭菌锅中灭菌。

1.4.2 种子前期处理 （1）挑选饱满且大小相同的白术种子100粒，分为2组，每组50粒。一组用自来水缓缓冲2h，剥去种皮，再在缓流下冲1h；另一组只用自来水冲洗3h，不剥去种皮。然后2组种子都用75%的酒精浸泡30s，用无菌水冲洗4次，将其播种于培养基上，每组5瓶，每瓶10粒，放于相同条件下培养，观察萌发情况和被污染的情况。（2）挑选50粒同样饱满且大小相同的白术种子，用自来水缓缓冲2h，剥去种皮，再在缓流下冲1h后，用75%的酒精浸泡30s，用无菌水冲洗4次，再用20mL的1%的NaClO溶液浸泡，然后将在NaClO溶液中浸泡的种子放在转速为180r/min、温度为28℃的摇床上振荡8h，换无菌水后仍放在相同转速和温度的摇床上振荡过夜后从摇床中取出，在超净工作台中用无菌水冲洗至无色后，接种于培养基上，每组5瓶，每瓶10粒。放于和上述相同的条件下培养，观察生长情况。

1.4.3 种子消毒处理 通过对种子前期处理的比较，选出最好的处理方法，接着进行以下实验：（1）设置相同的浸泡时间5min，将前期处理后的种子，分别放入以下5种浓度：6%、8%、10%、12%、14%的NaClO溶液中浸泡；（2）设置相同的浸泡时间10min，将前期处理后的种子，分别放入以下5种浓度：6%、8%、10%、12%、14%的NaClO溶液中浸泡；（3）设置相同的浸泡时间15min，将前期处理后的种子，分别放入以下5种浓度：6%、8%、10%、12%、14%的NaClO溶液中浸泡；（4）设置相同的浸泡时间20min，将前期处理后的种子，分别放入以下5种浓度：6%、8%、10%、12%、14%的NaClO溶液中浸泡；（5）设置相同的浸泡时间25min，将前期处理后的种子，分别放入以下5种浓度：6%、8%、10%、12%、14%的NaClO溶液中浸泡。然后将这些浸泡后的种子用无菌水冲洗，并且在冲洗的过程中要来回振荡烧杯，使烧杯中的种子与无菌水充分接触，直到烧杯中的无菌水呈现无色，停止冲洗。用吸水纸吸干种子表面的水分。将其播种在装有大约30mL的固体MS培养基的培养瓶中，每个培养瓶中放10粒种子，相同处理时间的每个浓度4瓶。把培养瓶放在20℃恒温条件下培养，观察种子的萌发情况和污染情况。

1.4.4 种子转移 通过以上的处理，在培养瓶中的种子有的会萌发，有的会被污染，也可能会萌发的同时也被污染，于是我们挑选出那些未被污染的种子，将其放在新的盛有培养基的培养瓶中，在相同的条件下培养，观察生长情况。若是仍有污染，则继续转移，直至没有污染，为培养出无菌苗奠定基础。

2 结果与分析

2.1 种子的前期处理 从表1可以看出，3组种子中都有未萌发的，原因可能是种子自身的因素，也可能是实验过程中试剂或是操作对其的影响。是否剥去种皮对种子的萌发影响很小，但污染的情况却不同：剥去种皮后，污染率较低，而未剥去种皮的污染率较高，原因可能是种皮上带有大量的霉菌、细菌等微生物；而NaClO溶液浸泡的的种子虽然污染率降低了，但萌发率却不高，可能是由于在NaClO溶液中浸泡时间过长，影响了种子的活力，从而影响种子的萌发率。通过以上3组实验的比较，选取用自来水缓缓冲2h，剥去种皮，再在缓流下冲1h的方法对种子进行前期处理，效果最好。

表1 种子剥皮与否和NaClO溶液处理后的观察结果

[组别＼&接种数

（粒）＼&萌发数

（粒）＼&污染数

（粒）＼&萌发率

（%）＼&污染率

（%）＼&剥皮＼&50＼&44＼&42＼&88＼&84＼&未剥皮＼&50＼&41＼&48＼&82＼&96＼&NaClO溶液的处理＼&50＼&31＼&39＼&62＼&78＼&]

2.2 种子的消毒处理 从表2～表6可以看出，随着NaClO溶液浓度的增加，相同时间浸泡的种子的发芽率逐渐降低，而杀菌效果却呈上升趋势；而且随着浸泡时间的延长，相同浓度的溶液浸泡后发芽的种子数目在下降，而杀菌效果越来越好。表2和表3中，虽然萌发率很高，但污染却较为严重；表5和表6污染率较低，但萌发率也低；表4中的萌发率都在50%之上，而污染率除了浓度为6%的其他浓度浸泡后都在50%之下，较为理想。通过以上的比较，选取表4中，即选择用不同浓度的NaClO溶液浸泡15min效果最佳。当NaClO的浓度为8%、10%时，种子的萌发率和杀菌效果较为理想，效果较好。又通过转移后种子和无菌苗的生长状况，选取10%的效果最好。

表2 不同浓度NaClO溶液处理种子5min的效果

[NaClO浓度（%）＼&接种数

（粒）＼&萌发数

（粒）＼&污染数

（粒）＼&萌发率（%）＼&污染率（%）＼&6＼&40＼&34＼&32＼&85＼&80＼&8＼&40＼&32＼&31＼&80＼&77.5＼&10＼&40＼&30＼&29＼&75＼&72.5＼&12＼&40＼&27＼&28＼&67.5＼&70＼&14＼&40＼&24＼&25＼&60＼&62.5＼&]

表3 不同浓度NaClO溶液处理种子10min的效果

[NaClO浓度（%）＼&接种数

（粒）＼&萌发数

（粒）＼&污染数

（粒）＼&萌发率

（%）＼&污染率

（%）＼&6＼&40＼&33＼&32＼&82.5＼&80＼&8＼&40＼&31＼&30＼&77.5＼&75＼&10＼&40＼&29＼&28＼&72.5＼&70＼&12＼&40＼&25＼&25＼&62.5＼&62.5＼&14＼&40＼&22＼&23＼&55＼&57.5＼&]

表4 不同浓度NaClO溶液处理种子15min的效果

[NaClO浓度（%）＼&接种数

（粒）＼&萌发数

（粒）＼&污染数

（粒）＼&萌发率

（%）＼&污染率

（%）＼&6＼&40＼&31＼&23＼&77.5＼&57.5＼&8＼&40＼&30＼&20＼&75＼&50＼&10＼&40＼&28＼&18＼&70＼&45＼&12＼&40＼&25＼&17＼&62.5＼&42.5＼&14＼&40＼&21＼&15＼&52.5＼&37.5＼&]

表5 不同浓度NaClO溶液处理种子20min的效果

[NaClO浓度（%）＼&接种数

（粒）＼&萌发数

（粒）＼&污染数

（粒）＼&萌发率

（%）＼&污染率

（%）＼&6＼&40＼&23＼&18＼&57.5＼&45＼&8＼&40＼&20＼&16＼&50＼&40＼&10＼&40＼&18＼&15＼&45＼&37.5＼&12＼&40＼&17＼&13＼&42.5＼&32.5＼&14＼&40＼&15＼&11＼&37.5＼&27.5＼&]

表6 不同浓度NaClO溶液处理种子25min的效果

[NaClO浓度（%）＼&接种数

（粒）＼&萌发数

（粒）＼&污染数

（粒）＼&萌发率

（%）＼&污染率

（%）＼&6＼&40＼&19＼&16＼&47.5＼&40＼&8＼&40＼&17＼&14＼&42.5＼&35＼&10＼&40＼&14＼&13＼&35＼&32.5＼&12＼&40＼&13＼&11＼&32.5＼&27.5＼&14＼&40＼&10＼&8＼&25＼&20＼&]

3 结论

对白术种子萌发的研究是本实验的目的，为了提高播种质量，预先要进行浸种催芽处理[5]。浸种时间的长短，对种子的吸水情况有显著影响，而合适的浸种时间有利于提高种子的发芽率。而对种子浸种产生的效果，专家学者们却持不同的看法，一种看法是种子催芽前不适宜浸种，因为浸种后种子的发芽率会降低[6]，另一种看法是浸种时间的长短对种子的发芽率并没有显著的影响[7-8]。也有人认为，浸种时间过长，会影响种子发芽率的提高。而本实验直接采用流水对种子进行冲，而后又通过不同处理条件对白术种子进行消毒，从而找到最优化的处理条件，获得无菌苗，为进一步利用无菌苗的根、茎、叶诱导毛状根奠定基础。

本实验表明，用自来水缓缓冲2h，剥去种皮，再在缓流下冲1h，然后用75%的酒精浸泡30s，用无菌水冲洗4次；再在浓度为10%的NaClO溶液中浸泡15min，最后将这些浸泡后的种子用无菌水冲洗至无色；用吸水纸吸干种子表面的水分。将其播种在装有大约30mL的固体MS培养基的培养瓶中进行培养，效果最佳。图1为经过以上步骤后萌发的种子。

图1 种子萌发情况

4 讨论

水是种子萌发必不可少的条件之一，而吸取足够的水分是种子能够独立生活的第一步[9]，也是关键的一步。在用自来水冲的过程中，水的流速应适中，且应使种子都与水接触，否则会影响种子的发芽率；在种子萌发的过程中，会有部分的种子腐烂变黑，可能是结实期种子受病虫危害[10]所导致的。在剥去种皮的过程中，注意不要伤到胚乳，因为胚乳是种子集中养料的地方，而且种子在脱离胚乳的环境中，即使在适于胚生长的条件下，仍不能生长与分化，这充分证明了胚本身也是休眠的[11]；同时更要注意的是不要伤到胚，因为胚对于种子来说非常重要，将来会发育成植物的器官。

关于种子的消毒剂有很多种，其中升汞的消毒效果最好[12]，但由于升汞毒性较大，因此本文选用NaClO溶液进行消毒。种子的生活力与发芽率有明确的相关性[13]，随着NaClO溶液浓度的增加，进而影响种子的生活力，导致种子萌发率降低；同时NaClO溶液的浓度越大，对霉菌细菌等微生物的生长起抑制作用，从而起到杀菌的效果；随着处理时间的延长，NaClO溶液会破坏细胞膜的通透性，进入细胞，影响酶的活性，甚至使种子完全失活，从而影响种子的萌发率。不同浓度的NaClO溶液对白术种子处理不同的时间后，获得的无菌苗生长情况如图2所示。而不同消毒条件对幼苗后续生长的影响，还有待于作进一步的研究。

图2 无菌苗生长情况

参考文献

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[12]张继红，靳世峰，何宝林，等.不同浓度沼液浸种对甜瓜种子的影响[J].长江蔬菜，2012（20）：31-34.

[13]沈宇峰，王志安，俞旭平，等.白术种子生活力测定方法及其与发芽率的相关性研究[J].中国中药杂志，2008，33（3）.

（责编：张宏民）