非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊对斑秃小鼠IL-7/IL-7Rα信号通路和Tregs细胞亚群的影响

苏家光 黄家灿 罗世斌 陈信津 郑文军

[摘要]目的：研究1 565 nm非剝脱点阵激光联合侧柏叶酊（Platycladus orientalis tincture， POT）对斑秃（Alopecia areata， AA）小鼠治疗作用以及对白细胞介素7（Interleukin 7， IL-7）/白细胞介素7受体α（Interleukin-7 receptor α， IL-7Rα）信号通路和调节性T细胞（Regulatory T cells， Tregs）亚群的影响。方法：将50只成年雄性C3H/HeJ小鼠随机分为对照组（C组），模型组[M组，环磷酰胺（Cyclophosphamide， CTX）诱导AA模型]，M+1 565 nm组（1 565 nm非剥脱点阵激光治疗AA），M+POT组（POT治疗AA）、M+1 565 nm+POT组（1 565 nm非剥脱点阵激光联合POT治疗AA），每组10只。流式细胞术检测C组和M组皮损组织中Tregs细胞亚群的比例和所有组血液中单个核细胞中Tregs细胞亚群的比例。Western blot法检测各组小鼠皮损组织中IL-7和IL-7Rα的表达。结果：与C组比，M组皮肤组织IL-7和IL-7Rα的表达均明显增加，而且Tregs细胞比例明显减少（P＜0.05）。与M组比，M+1 565 nm组和M+POT组IL-7的表达均降低（P＜0.05）。与M组比，M+1 565 nm+POT组IL-7和IL-7Rα的表达均降低，且Tregs细胞比例都显著增加（P＜0.05）。结论：1 565 nm非剥脱点阵激光联合POT治疗可以抑制斑秃小鼠IL-7/IL-7Rα信号并减少Tregs细胞的比例。

[关键词]1 565 nm非剥脱点阵激光；斑秃小鼠；侧柏叶酊；白细胞介素7；白细胞介素7受体α；调节性T细胞群

[中图分类号]R758.71    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）05-0005-04

Effects of Non-ablative Fractional Laser Combined with Platycladus Orientalis Tincture on IL-7/IL-7Rα Signaling Pathway and Tregs Cell Subsets in

Alopecia Areata Mice

SU Jiaguang， HUANG Jiacan， LUO Shibin， CHEN Xinjin， ZHENG Wenjun

（Department of Dermatology， the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530021， Guangxi， China）

Abstract： Objective  To investigate the therapeutic effect of 1 565 nm non-ablative fractional laser combined with Platycladus orientalis tincture （POT） on alopecia areata （AA） mice， and its impact on the IL-7/IL-7Rα signaling pathway and regulatory T cell （Treg） subsets. Methods  Fifty adult male C3H/HeJ mice were randomly divided into control group （C group）， model group （M group， induced with cyclophosphamide （CTX） to establish AA model）， M+1565 nm group （treated with 1 565 nm non-ablative fractional laser for AA）， M+POT group （treated with POT for AA）， and M+1565 nm+POT group （treated with both 1 565 nm non-ablative fractional laser and POT for AA）， 10 mices in each group. Flow cytometry was used to detect the proportion of Treg subsets in the skin lesions of the C group and M group and in the peripheral blood mononuclear cells of all the groups. Western blot was used to detect the expression of IL-7 and IL-7Rα in the skin lesions of each group of mice. Results  Compared with the C group， the expression of IL-7 and IL-7Rα in the skin lesions of the M group was significantly increased， while the proportion of Tregs cells was significantly decreased （P＜0.05）. Compared with the M group， the expression of IL-7 in the M+1 565 nm group and M+POT group was decreased （P＜0.05）. Compared with the M group， the expression of IL-7 and IL-7Rα in the M+1565 nm+POT group was decreased， and the proportion of Tregs cells was significantly increased （P＜0.05）. Conclusion  The combination of 1 565 nm non-ablative fractional laser combined with POT can inhibit the IL-7/IL-7Rα signaling pathway and reduce the proportion of Tregs cells in AA mice.

Key words： 1 565 nm non-ablative fractional laser; alopecia areata mice; Platycladus orientalis tincture; Interleukin 7; Interleukin-7 receptor α; regulatory T cell population

斑秃是一种T细胞介导的自身免疫性疾病[1]。在全球范围内，AA的终生发病率约为0.5%～3.0%，且14%～25%的AA患者会出现大面积头发脱落[2]，对人们的心理健康以及生活质量有严重的负面影响[3]。研究表明，弱激光疗法可促进皮肤细胞的活性[4]，而且1 565 nm非剥脱点阵激光治疗斑秃的疗效显著[5-6]。另外，侧柏叶酊作为一种生发乌发功效的传统中药，对于改善斑秃和雄性激素性脱发具有明显的帮助[7-8]。但是，1 565 nm非剥脱点阵激光和侧柏叶酊对斑秃的治疗的内在分子机制并不清楚。临床研究表明AA患者皮肤的炎症反应增加[9]，近期研究还发现AA患者和C3H/HeJ小鼠的损伤皮肤中IL-7明显上调[10]，外源性IL-7通过增加脱发组织T细胞的扩增加速AA的发生，而阻断IL-7可阻止C3H/HeJ小鼠AA的进展并逆转早期AA[11]。在AA小鼠体内阻断IL-7Rα也可以显著抑制多数T细胞亚群的数量，但可以维持Tregs群的数量。然而，1 565 nm非剥脱点阵激光和POT对斑秃治疗过程中对IL-7/IL-7Rα信号通路和Tregs的比例的调控作用并不清楚。因此，本研究主要探讨1 565 nm非剥脱点阵激光和POT单独治疗以及二者联合治疗分别对AA模型小鼠IL-7/IL-7Rα信号通路和Tregs的调控作用。

1  材料和方法

1.1 材料：POT为自行制备（侧柏叶15 g粉碎成粗粉，置密闭玻璃容器加70%乙醇300 ml浸泡1周后，取上清）。磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-phosphate dehydrogenasem，GAPDH）、IL-7、IL-7Rα的一抗均购于英国Abcam公司。HRP连接抗小鼠IgG（#7076P2）购于美国Cell Signaling Technology公司。RIPA裂解缓冲液（P0013B）、PMSF（ST505）、BCA蛋白检测试剂盒（P0010）、SDS-PAGE蛋白负载缓冲液（5X）（P0015L）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（P0012A）、BeyoECL Plus （P0018S）均来自上海碧云天生物科技有限公司。10X TBST缓冲液（C520009）购于由上海三工生物科技有限公司。苏木精伊红染色试剂（1092490500）购于美国默克KGaA公司。CD4+CD25+Foxp3+抗体组合TregFlowEX试剂购于武汉AmyJet公司。

1.2 方法

1.2.1 动物的管理：本研究中使用的所有实验程序和方案都经过笔者医院伦理委员会的审查和批准。8周龄雄性C3H/HeJ小鼠50只，由广西医科大学提供（动物生产许可证号：SCXK桂2020-0003），小鼠均适应环境1周，自由摄入食物和水。小鼠均在温度为（23±2）℃、湿度为35%～60%、12 h明暗循环的受控屏障设施中饲养。

1.2.2 小鼠的分组处理：使用随机数表法将50只小鼠随机分为对照组（C组），模型组（M组），1 565 nm非剥脱点阵激光治疗组（M+1 565 nm组），侧柏叶酊治疗组（M+POT组）、1 565 nm非剥脱点阵激光联合POT治疗组（M+1 565 nm+POT组），每组10只。M组小鼠接受融化的松香和石蜡涂背脱毛，随后，用150 mg/kg CTX腹腔注射C3H/HeJ小鼠8 d后诱导斑秃模型。C组为不进行任何药物处理健康小鼠。M+1 565 nm组在注射CTX的同时（方案同M组）使用科医人医疗激光设备公司生产的1 565 nm非剥脱点阵激光设备治疗2天/次，持续8 d，脱毛皮肤为激光治疗部位，治疗时激光设备轻柔接触皮肤，避免造成额外的机械压力。M+POT组在注射CTX的同时（方案同M组）用5%POT在脱毛部位轻微按摩3 min，1天/次，持续8 d。M+1 565 nm+POT组在注射CTX（方案同M组）的同时用1 565 nm非剥脱点阵激光设备治疗2天/次，并用5%POT在脱毛部位轻微按摩3 min，1天/次，持续8 d。每天监测小鼠的皮肤颜色和毛发再生情况。8 d后安乐死小鼠收集小鼠血液和皮肤毛囊组织。血液分离单个核细胞后存于4℃，用于流式细胞术检测。收集的新鲜皮肤毛囊组织存于-80℃用于Western blot实验，剩余病灶部位皮肤组织用于病理检测。

1.2.3 HE染色：将C组和M组的皮肤组织固定在10%中性缓冲福尔马林中并脱水。进行石蜡包埋，获得的石蜡块使用手动旋转切片机Leica RM2235切片机切成4μm薄片。所有切片随后根据HE染色试剂盒提供的说明进行染色，随后乙醇中脱水，然后在二甲苯中清洗，随后封上盖玻片后在莱卡光学显微镜下观察放大200倍的组织结构。

1.2.4 流式细胞术：分离各组小鼠血液中的PBMCs以及C组和M组小鼠皮损组织中的PMBCs。为分析其中Tregs细胞的比例，将PBMCs细胞用CD4-FITC、CD25-PE、以及FOXP3-APC抗体进行孵育，细胞被标记后，严格的门控条件下分选CD4+、CD25+、FOXP3+细胞，用FACSCalibur流式细胞仪进行比例分析。

1.2.5 Western blot：根据蛋白裂解液说明书，各组毛囊组织（50～80μg）用RIPA缓冲液匀浆，并提取总蛋白。采用二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白测定试剂盒进行蛋白浓度的定量分析。在沸水中使蛋白变性，分离不同大小的蛋白用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。对含有蛋白的凝胶进行湿法转膜，待蛋白转移到聚偏二氟乙烯PVDF膜上后，用5%脱脂牛奶进行封闭，然后与抗IL-7的一抗（1∶600）和抗IL-7Rα的一抗（1∶800）4℃孵育过夜。使用PBST清洗抗体后，进一步与辣根偶联二抗（1∶5 000）孵育，并用增强化学发光试剂孵育条带。利用Image J软件对条带的光密度进行分析。

1.3 统计学分析：本研究的数据都使用GraphPad PRISM 5.01进行数据录入和统计学分析，正态分布的数据表示为均数±标准差，多组间比较用单因素方差分析（ANOVA），两两比较行LSD-t检验。检验水准为α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 AA小鼠模型：本研究用CTX诱导小鼠8 d，结果显示，与C组比，M组可观察到小鼠背部和腹部部分区域毛发出现明显脱落，导致皮肤出现多个具有斑秃特征的裸露部位（见图1A）。HE染色观察到M组皮损部位淋巴细胞数目、中性粒细胞数据明显增加，说明此部位炎症细胞浸润增多（见图1B）。结果表明CTX成功诱导了小鼠斑秃模型。

2.2 小鼠皮损组织中Tregs的比例变化：流式细胞术检测皮损组织中Tregs的比例和统计图结果显示，M组小鼠皮损组织中Tregs的比例明显低于C组，差异有统计学意义（t=45.822，P=0.006）。见图2。

2.3 各组小鼠毛囊组织中IL-7和IL-7Rα的表达比较：与C组比，M组IL-7蛋白表达上调（约3.3倍）（t=28.336，P=0.015），且IL-7Rα的表达上调（约4.9倍）（t=46.075，P=0.007），差异均有统计学意义。对比M组，M+1 565 nm组和M+POT组IL-7蛋白的表达水平都降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），而IL-7Rα的表达水平变化无统计学意义（P＞0.05）。但是与M组比，M+1 565 nm+POT组IL-7和IL-7Rα的表达都明显下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与M+1 565 nm组比，M+1 565 nm+POT組IL-7和IL-7Rα的表达均明显下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与M+POT组比，M+1 565 nm+POT组IL-7和IL-7Rα的表达也都明显下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

2.4 1 565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊治疗激活斑秃小鼠血液Treg细胞群：与C组相比，M组Tregs（CD4+CD25+Foxp3+）的比例降低了约75.1%，差异有统计学意义（t=35.115，P=0.010）。与M组相比，M+1 565 nm组和M+POT组Treg细胞比例变化不明显，差异均无统计学意义（P＞0.05）。但是与M组比，M+1 565 nm+POT组Treg细胞都明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与M+1 565 nm组比，M+1 565 nm+POT组Treg细胞比例增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与M+POT组比，M+1 565 nm+POT组Treg细胞比例增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

3  讨论

IL-7是外周调节免疫细胞存活和功能的重要因素，主要由淋巴组织和骨髓的基质细胞分泌，也可由皮肤组织产生[9，12]。研究表明，AA模型的C3H/HeJ小鼠损伤皮肤组织中的IL-7和IL-7Rα的表达水平上调[11，13]，而促炎细胞因子的增多与AA发展有密切关系[14]，当注射外源性IL-7后，AA的进展速度加快[11，15]。本研究观察到环磷酰胺可以诱导AA的发生，并同时促进了皮肤毛囊组织中IL-7和IL-7Rα的表达，而无论是1 565 nm非剥脱点阵激光治疗还是侧柏叶酊单独治疗，又或是两者联合治疗均可以在治疗8 d后抑制皮肤毛囊组织中IL-7的表达，但是对于IL-7Rα的影响仅存在于1 565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊治疗组。这表明1 565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊治疗能有效抑制AA中IL-7/IL-7Rα信号轴。

干扰素γ系统调控促进趋化因子释放是AA发病的关键机制之一，可以显著负调控Tregs的水平[16]。研究表明，IL-7能促进IFN-γ的表达并促进T细胞浸润[11，13，17]，IFN-γ也能诱导角质形成细胞中IL-7的表达[18]，表明皮肤中IFN-γ和IL-7信号级联之间存在正反馈调节[19]。IL-7是Treg细胞生存和功能的重要因素，IL-7及其受体参与T细胞依赖性自身免疫过程[12]。本研究通过流式细胞术分析表明，C3H/HeJ小鼠经过诱导建立AA模型后其皮损组织和血液单个核细胞中的Tregs明显减少。当使用1 565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊治疗后血液单个核细胞中Tregs增加了近2倍。但是单独1 565 nm非剥脱点阵激光治疗或者单独侧柏叶酊治疗并未对Tregs形成显著性影响。由于Tregs是通过抑制异常或过度的免疫反应来维持免疫自我耐受和免疫稳态的核心[20]，而且Treg缺陷可导致人类自身免疫性疾病和小鼠模型中耐受的丧失[21]。因此，增强Treg是治疗自身免疫性疾病的一种策略。本研究表明，1 565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊在治疗AA时可通过提高Tregs的水平并改变自身免疫耐受性。

有研究强调了IL-7/IL-7Rα通路在自身免疫疾病中的作用，且表明阻断IL-7Rα治疗AA可以消耗大部分效应T细胞，增加小鼠体内Treg的比例，从而在AA恢复中发挥作用[22]。本研究发现1 565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊治疗后IL-7/IL-7Rα通路被明显阻断，而且Tregs比例则显著增加，这表明1 565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊治疗可通过抑制IL-7/IL-7Rα通路的激活从而提高Tregs。而阻断IL-7Rα可以减轻促炎症反应，增加调节性T细胞的功能，并减少T细胞的浸润[23]，这说明了1 565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊治疗改善了小鼠体内的自身免疫反应，抑制了促炎症反应，其机制可能是促进了Tregs对机体过度免疫反应的抑制。

本研究仍存在一定不足，仍需要在小鼠AA模型中仔细评估用于提高Tregs比例的激光强度和侧柏叶酊的最大剂量。另外，需要持续增加样本量并统计分析1 565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊治疗下对AA的治疗效果。

综上所述，本研究证明了IL-7/IL-7Rα通路和Tregs细胞群在AA发生中的重压作用，并初步探明1 565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊对AA小鼠体内IL-7/IL-7Rα通路具有阻断作用而对Tregs细胞亚群具有明显的增加作用。

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[收稿日期]2023-01-16

本文引用格式：苏家光，黄家灿，罗世斌，等.非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊对斑秃小鼠IL-7/IL-7Rα信号通路和Tregs细胞亚群的影响[J].中国美容医学，2024，33（5）：5-9.