铁死亡在炎症微环境中抑制牙周膜干细胞增殖及成骨分化的作用

徐小倩 孙卫国 朱莹

[摘要]目的：研究铁死亡在炎症微环境中抑制牙周膜干细胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）增殖及成骨分化的作用。方法：培养PDLSCs，将不含药物培养基处理的细胞作为对照组，炎症组用含有10 μg/L TNF-α的培养基处理，铁死亡激动剂组用含有10 μg/L TNF-α及10 μmol/L Erastin的培养基处理，铁死亡抑制剂组用含有10 μg/L TNF-α及1 μmol/L Ferrostatin-1的培养基处理。检测各组细胞增殖活力、转铁蛋白受体1（Transferrin receptor 1，TfR1）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx4）的表达水平及成骨诱导分化后的钙结节数量、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活力、成骨标志基因Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨钙素（Osteocalcin，OCN）、骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）的表达水平。结果：炎症组TfR1表达水平高于对照组、GPx4表达水平低于对照组（P＜0.05）。炎癥组处理第3、5、7 d时的增殖活力，成骨诱导第21 d时的钙结节OD540水平，成骨诱导第7 d时的Runx2、OCN、OPN表达水平均低于对照组（P＜0.05）；铁死亡激动剂组的上述指标低于炎症组、铁死亡抑制剂组的上述指标高于炎症组（P＜0.05）。结论：炎症微环境下铁死亡的激活抑制PDLSCs的增殖及成骨分化。

[关键词]牙周膜干细胞；炎症微环境；铁死亡；增殖；成骨分化

[中图分类号]R781    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）05-0001-05

Role Ferroptosis in the Inhibition of Proliferation and Osteogenic Differentiation of Periodontal Membrane Stem Cell under Inflammatory Microenvironment

XU Xiaoqian， SUN Weiguo， ZHU Ying

（ Department of Stomatology， the First Hospital of Anhui University of Science&Technology  Huainan First People's Hospital， Huainan 232001， Anhui ，China ）

Abstract： Objective  To study the role and mechanism of ferroptosis in the inhibition of proliferation and osteogenic differentiation of periodontal membrane stem cells （PDLSCs） under inflammatory microenvironment. Methods  PDLSCs were cultured， cells treated with drug free medium served as control group， inflammation group was treated with medium containing 10 μg/L TNF-α， ferroptosis agonist group was treated with medium containing 10 μg/L TNF-α and 10 μmol/L erastin， and ferroptosis inhibitor group was treated with medium containing 10 μg/L TNF-α and 1 μmol/L ferrostatin-1. The expression levels of cell proliferation viability， transferrin receptor 1 （TfR1）， glutathione peroxidase （GPx4）， the number of calcium nodules， the alkaline phosphatase （ALP） viability， the expression levels of Runt-related transcription factor 2 （Runx 2）， osteocalcin （OCN）， and osteopontin （OPN） after osteogenic induction were measured. Results  TfR 1 expression level of the inflammation group was higher than the control group， GPx4 expression level was lower the control group （P＜0.05）.The proliferative activity of the inflammatory group at the 3rd， 5th and 7th day， the level of calcium nodules OD540 at the 21st day of osteogenesis induction， and the expression levels of Runx2， OCN and OPN at the 7th day of osteogenesis induction were lower than those of the control group （P＜0.05）. The above indexes in the iron death agonist group were lower than those in the inflammation group， and those in the iron death inhibitor group were higher than those in the inflammation group （P＜0.05）. Conclusion  The activation of ferroptosis in the inflammatory microenvironment suppresses PDLSCs proliferation and osteogenic differentiation.

Key words： periodontal ligament stem cells; nflammatory microenvironment; ferroptosis; proliferation; osteogenic differentiation

牙周炎是细菌感染引起的牙周组织慢性炎性疾病，可引起牙周支持组织破坏、牙槽骨吸收，最终导致牙齿脱落。牙周膜干细胞是用于牙周支持组织及牙槽骨修复的重要种子细胞，PDLSCs在牙周炎的局部微炎症环境中的增殖能力和成骨分化能力显著减弱，不利于PDLSCs在牙周炎治疗中发挥组织修复作用[1-2]。因此，深入认识PDLSCs增殖及成骨分化的调控机制，特别是在炎症微环境下的增殖及成骨分化调控机制对牙周炎的治疗至关重要。铁死亡是新发现的一种铁依赖性新型细胞死亡形式，对细胞的增殖和分化均具有调控作用，有研究报道高糖环境下铁死亡的激活对基质细胞的成骨分化具有抑制作用[3]。炎症是刺激铁死亡激活的重要因素之一，牙周炎发病过程中存在铁死亡的激活[4]，但炎症微环境下PDLSCs铁死亡的变化及其对细胞增殖、成骨分化的调控作用缺乏研究证据。因此，本研究将通过细胞实验探究铁死亡在炎症微环境抑制牙周膜干细胞增殖及成骨分化中的作用。

1  材料和方法

1.1 材料和试剂：PDLSCs细胞株（LM-H002）购自上海联迈生物工程有限公司。TNF-α、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、茜素红购自美国Sigma公司，铁死亡激动剂Erastin、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1购自美国MCE公司，CCK8法细胞增殖检测试剂盒、ALP活性检测试剂盒购自上海碧云天生物科技公司，细胞RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、荧光定量检测试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司，TfR1、GPx4、Runx2、OCN、OPN及β-actin的特异性一抗及辣根过氧化物酶二抗均购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 PDLSCs培养及分组：PDLSCs在含有10%胎牛血清的培养基中贴壁培养，每2 d更换1次培养基，待细胞密度达到90%时用胰蛋白酶进行消化，消化后的细胞继续传代培养。取第3代PDLSCs進行分组，方法如下。对照组用不含药物的培养基处理，炎症组用含有10μg/L TNF-α的培养基处理，铁死亡激动剂组参照Li Y等[5]的研究确定Erastin的剂量为10μmol/L、用含有10μg/L TNF-α及10μmol/L Erastin的培养基处理，铁死亡抑制剂组参照李畅等[6]的研究确定Ferrostatin-1的剂量为1μmol/L、用含有10μg/L TNF-α及1μmol/L Ferrostatin-1的培养基处理。

1.2.2 PDLSCs干细胞特性的鉴定：取第3代PDLSCs，胰蛋白酶消化后收集细胞，4℃避光孵育CD44、CD90抗体1 h，在流式细胞仪上检测CD44、CD90的表达情况。

1.2.3 PDLSCs增殖活力的检测：第3代PDLSCs接种在96孔培养板内，分组处理1 d、3 d、5 d、7 d时采用CCK8法进行检测，按照试剂盒说明书在每个培养孔内加入CCK8检测液10μl，继续孵育2 h后在酶标仪上检测490 nm波长的吸光值，以该吸光值反映细胞增殖活力。

1.2.4 PDLSCs的成骨诱导：培养成骨诱导培养液，包括0.1μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C、10%胎牛血清。将第3代PDLSCs接种在6孔培养板内，待细胞达70%汇合后，用成骨诱导培养液配置10μg/L TNF-α、10μmol/L Erastin、1μmol/L Ferrostatin-1，每2 d更换1次。

1.2.5 PDLSCs成骨诱导后茜素红染色：PDLSCs成骨诱导后第21天时，用1%茜素红染色液对细胞进行染色20 min，观察钙结节并拍照记录，加入1 ml十六烷基吡啶溶解钙结节，震荡后吸取100μl移入96孔培养板，在酶标仪上测定540 nm波长的吸光值OD540。

1.2.6 PDLSCs成骨诱导后ALP活力检测：PDLSCs成骨诱导后第3天、第5天、第7天时，采用ALP检测试剂盒进行检测，按照试剂盒说明书进行操作，在酶标仪上测定标准品和待测样品的510 nm波长吸光值，根据标准品的吸光值绘制标准曲线，计算待测样品的ALP活力。

1.2.7 PDLSCs中成骨标志基因mRNA表达水平的检测：PDLSCs成骨诱导后第7天时，采用细胞RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，采用cDNA第一链合成试剂盒将细胞中提取得到的RNA反转录为cDNA。采用荧光定量检测试剂盒对cDNA中的Runx2、OCN、OPN进行荧光定量PCR检测，PCR的体系为：cDNA 1μl、试剂盒中反应混合液10μl、上下游引物各0.6μl，去离子水补足至20μl；PCR的反应程序为：95℃预变性3 min，95℃ 15 s、特异性退火温度25 s、72℃ 30 s，共进行40个循环的荧光定量PCR反应，反应结束后得到得到循环曲线及循环阈值（Ct），以β-actin为内参、按照公式2-△△Ct计算GPx4、TfR1、Runx2、OCN、OPN的mRNA表达水平。

1.2.8 PDLSCs中成骨标志基因蛋白表达水平的检测：PDLSCs成骨诱导后第7天时加入裂解液提取蛋白，进行Western blot检测。在测定蛋白含量后取20μg蛋白样本加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离后将分离的蛋白质电转移至NC膜，5%脱脂牛奶室温封闭NC膜1 h，4℃孵育1∶1 000稀释的GPx4、TfR1、Runx2、OCN、OPN、β-actin抗体或1∶5 000稀释的β-actin的抗体过夜；第2天，室温孵育1∶2 000稀释的HRP标记的二抗1 h，显色后在凝胶成像系统中观察蛋白条带，根据条带灰度值计算GPx4、TfR1、Runx2、OCN、OPN的蛋白表达水平。

1.3 统计学分析：采用SPSS 23.0软件进行统计学处理，实验数据为计量资料，以均数±标准差表示，采用独立样本t检验或单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 PDLSCs干细胞特性的鉴定：经流式细胞术检测PDLSCs表面CD44及CD90的阳性表达率均超过99%，符合干细胞的特征。见图1。

2.2 炎症微环境下PDLSCs中铁死亡标志基因表达的影响：炎症组PDLSCs中GPx4的mRNA表达水平和蛋白表达水平均低于对照组，TfR1的mRNA表达水平和蛋白表达水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3 铁死亡在炎症微环境下对PDLSCs增殖的影响：处理第1天时，各组PDLSCs的增殖活力比较差异无统计学意义（P＞0.05）；处理第3、5、7天时，炎症组PDLSCs的增殖活力低于对照组，铁死亡抑制剂组PDLSCs的增殖活力高于炎症组，铁死亡激动剂组PDLSCs的增殖活力低于炎症组（P＜0.05）。见图3。

2.4 铁死亡在炎症微环境下对PDLSCs成骨诱导后钙结节的影响：成骨诱导21 d时进行茜素红染色，炎症组PDLSCs的钙结节数量少于对照组、OD540水平低于对照组，铁死亡抑制剂组PDLSCs的钙结节数量多于炎症组、OD540水平高于炎症组，铁死亡激动剂组PDLSCs的钙结节数量少于炎症组、OD540水平低于炎症组（P＜0.05）。见图4。

2.5 铁死亡在炎症微环境下对PDLSCs成骨诱导后ALP活力的影响：成骨诱导3 d、5 d、7 d时，炎症组PDLSCs的ALP活力低于对照组，铁死亡抑制剂组PDLSCs的ALP活力高于炎症组，铁死亡激动剂组PDLSCs的ALP活力低于炎症组（P＜0.05）。见图5。

2.6 铁死亡在炎症微环境下对PDLSCs成骨诱导后成骨标志基因表达的影响：成骨诱导3 d、5 d、7 d时，炎症组PDLSCs中Runx2、OCN、OPN的mRNA表达水平和蛋白表达水平低于对照组，铁死亡抑制剂组PDLSCs中Runx2、OCN、OPN的mRNA表达水平和蛋白表达水平高于炎症组，铁死亡激动剂组PDLSCs中Runx2、OCN、OPN的mRNA表达水平和蛋白表达水平低于炎症组（P＜0.05）。见图6。

3  讨论

PDLSCs是组织工程领域重要的种子细胞，来源于牙周组织且具有自我更新、多向分化的潜能，在特定条件下发生成骨分化能够参与牙槽骨的重建和修复。牙槽骨的吸收和破坏是慢性牙周炎进展过程中的特征之一，PDLSCs能够用于牙槽骨的重建和修复，但PDLSCs在炎症微环境下增殖和成骨分化受到抑制，进而影响了PDLSCs对牙槽骨的重建和修复作用[7-9]。TNF-α处理是细胞实验中建立炎症微环境的常用方法，本研究的结果均证实TNF-α处理PDLSCs后细胞的增殖活力减弱，成骨诱导分化后的钙结节减少、ALP活力降低，与既往相关研究的结果一致[1-2]。但炎症微环境下PDLSCs增殖及成骨分化的调控机制尚不明确，深入研究相关的分子机制有助于为今后发现新的慢性牙周炎治疗靶点提供依据。

本研究以铁死亡为切入点，对炎症微环境下PDLSCs增殖和成骨分化受抑制的相关分子机制展开探索。铁死亡是一种新型细胞死亡方式，分子生物学表现为TfR1表达增加以及GPX4表达降低[10]；TfR1介导了三价铁的内吞及入核，继而促进铁死亡[11]；GPX4是还原过氧化物酶的关键酶，能够减轻铁死亡[12]。多项牙周炎相关的研究证实牙周炎患者、牙周炎动物模型、牙周炎细胞模型中均存在铁死亡的显著激活[13-15]。本研究在TNF-α处理的PDLSCs中检测到TfR1表达增加以及GPX4表达降低，提示PDLSCs在炎症微环境中出现了铁死亡的激活，与既往临床研究、动物实验和细胞实验的相关结果吻合。

铁死亡的生物学作用广泛，在细胞增殖及分化中均发挥调控作用。在多种组织损伤的模型中，铁死亡的激活显著降低细胞增殖活力、加重组织损伤[16-18]；在干细胞和基质细胞成骨分化的研究中，铁死亡对成骨分化具有抑制作用。本研究在炎症微环境中观察了铁死亡对PDLSCs增殖和成骨分化的影响，分别在炎症微环境中使用铁死亡激动剂和抑制剂進行干预，使用激动剂进一步加剧了炎症微环境对PDLSCs增殖和成骨分化的抑制作用，而抑制剂明显改善炎症微环境对PDLSCs增殖和成骨分化的抑制作用。以上结果提示炎症微环境下铁死亡的激活对PDLSCs的增殖和成骨分化具有抑制作用。

成骨分化过程中存在多种成骨标志基因表达增加，其中Runx2是成骨分化过程中特异性高表达的转录因子，OCN和OPN是骨基质中主要非胶原成分，在骨质疏松的进展、成骨分化受抑的过程中Runx、OCN、OPN的表达均明显降低[19-20]。为深入认识炎症微环境中铁死亡对PDLSCs成骨分化的调控作用，本研究进一步对上述三种成骨标志基因的表达进行了检测，TNF-α处理后PDLSCs中Runx、OCN、OPN的表达降低，符合炎症微环境下PDLSCs成骨分化受抑制的特点；分别使用铁死亡激动剂和抑制剂后，PDLSCs中成骨标志基因的表达分别降低和增加，表明炎症微环境下铁死亡的激活抑制了PDLSCs中成骨标志基因的表达。

综上所述，炎症微环境下PDLSCs中铁死亡显著激活，异常激活的铁死亡对PDLSCs的增殖及成骨分化均具有抑制作用。在今后的临床实践中，抑制铁死亡有望成为治疗慢性牙周炎的新靶点，在炎症微环境下抑制铁死亡能够促进PDLSCs的增殖和成骨分化，进而有利于牙槽骨的重建和修复。

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[收稿日期]2023-02-15

本文引用格式：徐小倩，孫卫国，朱莹.铁死亡在炎症微环境中抑制牙周膜干细胞增殖及成骨分化的作用[J].中国美容医学，2024，33（5）：1-5.