勿忘我组培快繁技术的优化

曹君迈+彭亚齐+唐世明+陈淑媛+王彤彤+陈星

摘要：以蓝色勿忘我种子为材料，发芽后取其幼苗茎尖、叶片和下胚轴为外植体，进行勿忘我组培快繁技术的优化试验。通过研究外植体、接种方式、培养基配方、光质对勿忘我不定芽形成、增殖、生根的影响，优化筛选出适宜勿忘我组培的最佳外植体为茎尖，其诱导率最高达69.32%，其次为子叶，其诱导率为18.06%；适宜茎尖诱导分化的培养基为MS+0.9 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT，诱导率最高达83.33%；适宜子叶诱导分化的培养基为 MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT，诱导率最高达20.83%；适宜增殖培养的培养基为1/2MS（不加肌醇，将维生素B1提高到1 mg/L）+0.4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT，增殖系数为16.5；适宜生根的培养基为1/2MS+0.4 mg/L NAA，采用温差培养法，生根率提高到90%。适宜勿忘我增殖培养的光质为红光，之后转入白光进行培养。本试验的结果可为勿忘我组培快繁技术的应用提供一定的技术支撑。

关键词：勿忘我；外植体；增殖；生根；光质

中图分类号： S682.390.4+3文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0077-04

勿忘我（Limonium sinuatum）属补血草属植物，全世界植物资源有300种，我国有十七八种[1]，主要分布于西北、东北和华北，即新疆、甘肃、内蒙古和宁夏等省。补血草属多为耐盐抗旱的旱生植物，是我国优良的野生植物资源，具有很高的观赏价值、极高的药用价值；而其花多、花期长、泌蜜丰富，是重要的夏秋季蜜源植物；由于其耐盐、抗寒、抗旱性强、节水显著等特性，在防风固沙、生态恢复中具有重要的应用价值[2]。随着人们对环境美化的需求和保健意识的增强，市场需求量快速发展，利用组培快繁技术，提高组培苗的增殖率及有效苗的数量和质量，解决市場需求，达到资源利用和保护的协调发展。

勿忘我是补血草中的一种，它具有大量的不孕枝和同型杂交不孕的特点，种子结实少，限制了它的规模化生产的发展[3]，此外，成本过高也是影响规模化、产业化生产的又一因素。有关勿忘我组织培养国内外已有许多报道[4-9]，近年来勿忘我采用组培快繁技术，不仅繁殖系数高，还可有效去除病毒，以确保遗传性状的稳定性和切花质量的改善。在勿忘我组培快繁的研究中，有许多关于诱导[10]、增殖[11]、生根及炼苗[12-13]的研究报道，通过大量试验，究者们已经筛选出一些适宜的培养基配方及培养条件。在兼顾增殖率与组培苗质量的前提下，正在努力使勿忘我组培苗快速产业化，以满足市场的需求。本试验在确保组培苗增殖率和质量的前提下，以降低成本和加快繁殖速度为目标，研究组培快繁过程中各环节的关键影响因子，建立高效实用的勿忘我组培快繁技术体系，以期为产业化开发提供技术支撑。

1材料与方法

1.1试验材料

蓝色勿忘我种子网购于浙江永康无市花之谷贸易有限公司。

1.2试验方法

1.2.1培养基配方试验培养基配方详见表1。

1.2.2光质条件试验光质条件详见表2。

1.2.3试验设计方法在诱导分化培养、增殖培养和生根培养阶段，针对各阶段的特点，分别对外植体、培养基配方采用单因素随机区组设计；在增殖培养条件的筛选中，采用单因素设计研究7种光质因子的影响。每个处理接种8瓶，每瓶内接入4个外植体。在试验过程中，对出愈率、诱导分化率、玻璃化率、增殖系数、生根率、叶片数、叶绿素含量等指标进行统计，记载时随机抽取2瓶，求其平均值作为1次重复，共重复3次，并对试验结果采用单因素统计学方法分析。

1.2.4材料的处理采用陈淑媛等的方法[6]进行。

1.2.5种子的萌发将消毒灭菌后的种子接种到MS+3%蔗糖+7%琼脂培养基上后，放置于黑暗处，（25±2） ℃温度下，待发芽长出具有2张子叶的幼苗后置于光照下培养，子叶变绿后进行起始培养。统计每瓶MS培养基内接入的种子数和发芽种子数，计算其发芽率。

1.2.6诱导分化培养在超净工作台上，按无菌操作技术要求分别切取勿忘我的下胚轴（长0.5 cm）、茎尖（长0.5～1.0 cm）、子叶作为外植体，3种外植体均接种到起始培养基A1～A5号上。下胚轴与茎尖的形态学下端插入培养基；子叶均匀划3刀，分正反（光照面朝上为正放，朝下为反放）接种于培养基内。

1.2.7增殖培养在超净工作台上，按无菌操作技术要求，切取同一种培养基中长势相似的勿忘我带芽幼苗茎尖（长 0.5～1.0 cm） 为外植体， 接种于增殖培养基B1～B5号上进

1.2.8生根培养在超净工作台上，按无菌操作技术要求，取同一种培养基中大小相似、具3～5张叶的、高大于2.0 cm的无根苗，分成单株接种于生根培养基C1～C5号中，采用变温培养法培养。

1.2.9光质对勿忘我组培苗增殖的影响在超净工作台上，按无菌操作技术要求，切取同一种培养基中长势相似的勿忘我带芽幼苗茎尖（长0.5～1.0 cm）为外植体，接种于增殖培养基B2号（MS+0.4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT）上进行丛生芽诱导的培养。

1.2.10叶绿素含量的测定离体法萃取叶绿素及分光光度计法测定步骤：取适量新鲜叶片→吸水纸擦干净→去主脉→剪成小于1 mm2的小块，混匀→称取0.2 g至研钵中→加入 5 mL 95%乙醇、少量碳酸钙粉末，研磨至叶片组织变白→静置3～5 min→过滤至烧杯中→定容至25 mL容量瓶中→652 nm 下测D值，95%乙醇调零。

叶绿素总含量（mg/g）=（D652 nm×V）/（34.5×m）。

式中：V为提取液总量，mL，如果比色前进行稀释，则应乘以稀释倍数；m为称取叶片质量，g。

1.3培养条件

诱导分化培养、增殖培养置于PGX-1000B型光照培养箱中暗培养，温度为（25±2） ℃。5 d后，设置光照度为 2 500 lx，光照时间为12 h/d，温度为（25±2） ℃进行光照培养。生根培养置于光照培养箱中，光照度为2 500 lx，光照时间为12 h/d，光照下温度为（28±2） ℃，黑暗下温度为（22±2） ℃。光质试验置于7种不同光质处理下培养，光照度为 2 500 lx，光照时间为12 h/d，温度为（25±2） ℃。

1.4指标记录

7 d后，每天观察记录每种培养基内组培苗的生长状况，30 d后调查其愈伤组织数、玻璃化苗数和正常小苗数、增殖芽数、生根数。

在光质试验中，于30 d后调查其增殖数、叶片数、茎长，测定叶绿素的含量，计算其增殖系数、平均叶片数、平均茎长、叶绿素含量。

2结果与分析

2.1种子萌发的调查

接入种子总数为199粒，发芽总数为128粒，发芽率为64.32%。勿忘我种子灭菌后影响了发芽率，可适当缩短 NaClO 灭菌的时间。

2.2诱导分化培养的研究

2.2.1外植体对不定芽形成的影响从表3可以看出，不同外植体间，不定芽的形成存在显著差异，茎尖的出愈率、玻璃化率和诱导分化率均显著高于子叶和下胚轴；子叶显著高于下胚轴。由此可见，外植体诱导不定芽能力从大到小为茎尖>子叶>下胚轴。

2.2.2不同培养基配方对茎尖不定芽诱导的影响接种后茎尖下端开始膨大，继而出现浅绿色颗粒状突起， 约3周后，2.2.3不同培养基配方对子叶不定芽诱导的影响子叶接种到培养基上后，伤口处膨大形成愈伤组织，形成少量不定芽。对表5数据进行统计学分析，培养基间对茎尖的出愈率、玻璃化率、诱导率的影响达到显著水平。其中，A5的出愈率显著高于A1、A2、A3和A4；A1、A2的出愈率显著高于A3、A4。A4的玻璃化率显著低于A1、A2、A3和A5；A3的玻璃化率显著低于A1、A2和A5；A1、A2的玻璃化率显著低于A5。A5的诱导率显著高于A1、A2、A3和A4；A2、A3的诱导率显著高于A1和A4；A1的诱导率显著高于A4。A5培养基的出愈率和诱导率虽然在所有培养基中最高，但其玻璃化率也最高，对后期的繁殖生长不利。综合考虑，A2培养基的效果最好，出愈率和诱导率适中，玻璃化率低。所以在子叶不定芽的诱导中，筛选的最佳诱导分化培养基为A2，即MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。

2.2.5不同培养基配方对下胚轴不定芽诱导的影响下胚轴在不定芽诱导过程中，虽然下端膨大，但没有产生愈伤组织，随着时间的推移发生褐化而死，最终仅有极少数不定芽产生。通过对表7数据进行统计学分析得出，不同培养基配方对下胚轴不定芽诱导的影响显著。5个处理间的出愈率、玻璃化率差异不显著，而诱导率差异显著。A1、A5的诱导率显著高于A3、A4；A1、A2、A5之间的诱导率差异不显著；A2、A3、A4之间的诱导率差异不显著。综合来看，A2的诱导率适中，而其成本低于A3、A4培养基，所以筛选的最佳诱导分化培养基为A2，即MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。

3结论与讨论

3.1讨论

本试验是在实验室前期研究的基础上[6]，针对试验方法和培养条件进一步深入研究探索，优化勿忘我组培快繁技术条件。前期研究中只采用茎尖诱导分化，而本次试验在诱导分化培养阶段也利用子叶和下胚轴进行不定芽的诱导，这增加了快繁诱导途径。结果表明，茎尖为诱导分化培养的最优外植体，这与王淑敏的试验结果[12]相符，但其诱导分化培养成分相同，但6-BA激素用量降低了0.1 mg/L。

本试验在研究子叶诱导不定芽过程中，研究正面反面放置2种接种方式对子叶不定芽诱导的影响，这是前人还没有研究过的。

本试验在增殖阶段对培养基进行改良，筛选出的最优增殖培养基大量元素减半、不加肌醇，且将维生素B1提高到 1 mg/L，增殖系数较陈淑媛等的[6]高，这与朱至清的研究结果[14]相吻合。与冯晓英的增殖培养研究[15]比，筛选的增殖培养基减少了营养成分，降低了生产成本，有利于组培工厂化生产的节体增效。

而在生根培养阶段，使用的生根培养基与陈淑媛等的[6]一样，但是利用温差培养法生根率提高了10%。这可能是因为在变温培养中，白天积累有机物，晚上减少有机物的消耗，使得勿忘我组培苗的有机物得以积累得更多，从而根粗苗壮。因此，可以在勿忘我组培快繁生根过程中将恒温培养法改为变温培养法。

在组织培养的微环境中，光是一个重要的因素，前人已经研究了光照时间、光照度对勿忘我组培苗生长的影响[16]。而光质对勿忘我增殖的影响目前还没有人研究，本试验中红光有利于勿忘我组培苗的增殖，再转入白光下培养进行壮苗，更有利于组培苗的生长。

而组培过程中的三大问题之一的玻璃苗，在本试验中也有出现。今后可以在预防和解决玻璃苗出现这一方面加大研究，以提高勿忘我组培苗的质量，为勿忘我的组培工厂化生产增产增效。

3.2结论

不定芽诱导过程中，外植体的筛选至关重要。勿忘我出芽情况以茎尖诱导率最高，而下胚轴和子叶则只能诱导少量不定芽。其诱导不定芽能力从大到小为茎尖>子叶>下胚轴。因此，诱导不定芽最佳的外植体为茎尖。

勿忘我茎尖不定芽的诱导培养阶段，在蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L、pH值为 5.8～6.0条件下，筛选出的最佳诱导分化培养基为MS+0.9 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。

在勿忘我子叶诱导不定芽的培养中，子叶正面放置有利于诱导不定芽，在蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L、pH值为5.8～6.0条件下，筛选的最佳诱导分化培养基为MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。

在勿忘我组培苗增殖过程中，以茎尖为外植体，在蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L、pH值为5.8～6.0条件下，筛选出的最佳增殖培养基为1/2MS（不加肌醇，将维生素B1提高到 1 mg/L）+0.4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。在蔗糖 15 g/L、琼脂7 g/L、pH值为 5.8～6.0、变温培养条件下，筛选的最佳生根培养基为1/2 MS+0.4 mg/L NAA。

适宜勿忘我增殖培养的光质条件为红光。因此，可以先将勿忘我组培苗置于红光条件下进行增殖培养，之后再转入白光条件下进行正常培养，促进壮苗，且能提高勿忘我组培苗的增殖系数。

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