基于网络药理学和生物信息学探讨生脉饮（党参方）治疗慢性心力衰竭的作用机制

张赤道，吴文俊，邢作英，邱伯雍，朱明军，王永霞

摘要目的：運用网络药理学和生物信息学方法，探究生脉饮（党参方）治疗慢性心力衰竭（CHF）的活性成分、作用靶点和分子通路，阐明生脉饮（党参方）治疗CHF的分子机制。方法：借助中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）以及BATMAN-TCM平台获取生脉饮（党参方）有效活性成分及化合物潜在靶点，检索GeneCards、治疗靶点数据库（TTD）、DrugBank、DisGeNET数据库，筛选CHF相关靶点；将化合物与疾病交集靶点通过STRING数据库构建蛋白相互作用（PPI）网络图，采用Cytoscape软件获得生脉饮（党参方）作用于CHF的关键化合物和核心靶点，使用R语言软件包进行基因本体（GO）生物学过程分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析并可视化，在基因表达综合数据库（GEO）下载CHF基因表达芯片，经过R语言软件包处理后验证核心靶点基因差异表达情况，最后，使用Autodock软件将有效成分和核心靶点进行分子对接再次验证，并将结果可视化展示。结果：共筛选得到35个有效化学成分、120个潜在靶点，获得菠菜甾醇、11-羟基兰金断肠草碱、α菠菜甾醇、邻苯二甲酸二异辛酯、黄豆黄素、去氧哈林通碱等有效成分，丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT1）、非受体酪氨酸激酶（SRC）、表皮生长因子受体（EGFR）等核心靶点，关键通路包括氧化应激、酪氨酸磷酸化修饰、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）等。GEO芯片验证结果显示核心靶点在健康组与疾病组之间差异表达明显。分子对接结果显示生脉饮（党参方）关键有效成分与核心靶点整体结合较好。结论：生脉饮（党参方）可能通过AKT1、SRC、EGFR、热休克蛋白（HSP90AA1）、前列腺素内过氧化物合酶 2（PTGS2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）等多靶点和PI3K/AKT信号通路改善心肌重塑、抑制细胞凋亡、调节雌激素、抗脂质及动脉粥样硬化等作用改善CHF。

关键词心力衰竭；生脉饮；网络药理学；生物信息学；活性成分；分子机制

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.08.001

The Mechanism of Shengmai Decoction（Dangshen Formula） for Treating Chronic Heart Failure Based on Network Pharmacology and Bioinformatics

ZHANG Chidao， WU Wenjun， XING Zuoying， QIU Boyong， ZHU Mingjun， WANG Yongxia

The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou 450000， Henan， China

Corresponding AuthorWANG Yongxia， E-mail： wyxchzhq@163.com

AbstractObjective：To explore the active ingredients，targets and molecular pathways of Shengmai Decoction（Dangshen Formula） for the treatment of chronic heart failure（CHF） using network pharmacology and bioinformatics，and to clarify the molecular mechanism of Shengmai Decoction（Dangshen Formula） in the treatment of CHF.Methods：Potential targets of active ingredients and compounds of Shengmai Decoction（Dangshen Formula） were obtained by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） and Batmatic-TCM platform.GeneCards，therapeutic target database（TTD），DrugBank and DisGeNET databases were searched to screen CHF-related targets.The protein interaction（PPI） network diagram was constructed by STRING database，and Cytoscape software was used to obtain the key compounds and core targets of CHF acted by Shengmai Decoction（Dangshen Formula）.The R language software package was used to analyze the biological process of gene ontology（GO） and the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway.The CHF gene expression chip was downloaded from the integrated gene expression database（GEO） and the differential expression of core target genes was verified after processing with the R language software package.The molecular docking of the active ingredient and the core target was verified again by  the Autodock software，and the results were visualized and displayed.Results：A total of 35 active chemical components and 120 potential targets were screened，and the active components such as spinach sterol，11-hydroxylanguinarianserine，α-spinach sterol，diisooctyl phthalate，soybean xanthin，and deoxynivalenol base，the core targets such as serine/threonine kinase（AKT1），non-receptor tyrosine kinase（SRC），and epidermal growth factor receptor（EGFR），and the key pathways including oxidative stress，tyrosine phosphorylation modification，phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B（PI3K/AKT） were obtained.The results of GEO microarray validation showed that the core targets were differentially expressed between the healthy and diseased groups.The results of molecular docking showed that the key active ingredients of Shengmai Decoction（Dangshen Formula） were well combined with the core targets.Conclusion：Shengmai Decoction（Dangshen Formula） might improve chronic heart failure through AKT1，SRC，EGFR，heat shock proteins（HSP90AA1），prostaglandin endoperoxide synthase 2（PTGS2），matrix metalloproteinases 9（MMP-9） and other multi-targets and PI3K/AKT signaling pathway，and improve cardiac remodeling，inhibit cell apoptosis，regulate estrogen，anti-lipid and atherosclerosis.remodeling，inhibition of apoptosis，regulation of estrogen，anti-lipid and atherosclerotic.

Keywordsheart failure; Shengmai Decoction; network pharmacology; bioinformatics; active ingredient; molecular mechanism

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由心肌病变、心脏负荷异常和心律失常等原因导致的心室收缩和（或）舒张功能下降，从而引起的一组复杂临床综合征［1］。据统计，至2022年，我国心血管疾病病人约3.30亿人，其中心力衰竭病人约890万人［2］。83%的心力衰竭病人每年至少住院1次，43%的病人每年至少住院4次［3］。目前，我国心力衰竭指南推荐血管紧张素受体-脑啡肽酶抑制剂、肾素-血管紧张素-醛固酮受体拮抗剂、β受体阻断剂、利尿剂等药物来治疗心力衰竭病人，从而延缓心力衰竭恶化以及降低病人死亡风险［4］。但是，由于慢性心力衰竭的病程持久性，长期使用这些治疗药物最终会出现多系统的不良反应，如低血压、肾衰竭、电解质紊乱等［5］。心力衰竭在中医归属于“心水病”，根据主要症状的不同，分属“痰饮”“水肿”“虚劳”的范畴。传统生脉饮来自《医学启源》，具有益气复脉、养阴生津的功效，其中人参药性温热，较为燥烈，主要应用于急性心肌梗死、心力衰竭等急重症病人，由其演变出的党参方，药性平和，不燥不腻，适用于慢性心血管疾病轻症病人长期服用，而无助邪之弊［6］。        生脉饮（党参方）化学成分复杂，作用靶点众多，现代药理学研究表明其对心血管疾病具有较好疗效，能够保护心脏功能，改善心脏状态，同时对其他系统疾病也具有不同程度的治疗作用［7］。但其对于慢性心力衰竭的干预作用机制尚不明确，缺乏分子靶点与通路信号的研究。因此，本研究通过网络药理学方法，建立生脉饮（党参方）-慢性心力衰竭-靶点互作网络，将中药复方众多有效活性成分和疾病作用靶点结合，从分子水平和作用通路探索其与临床疗效之间的关联，以期能够为临床治疗慢性心力衰竭用药提供参考。

1资料与方法

1.1生脉饮（党参方）化学成分及作用靶点筛选

检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）数据库和BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）数据库中生脉饮（党参方）的各味中药，包括党参、麦冬、五味子，并根据口服生物利用度（OB）、类药性（DL）筛选出符合条件（OB≥30%，DL≥0.18）的候选化学成分［8］。通过查阅网络文献补充因上述条件被删除，但是对疾病具有潜在疗效的化学成分。之后在PubChem（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库获取其有效成分的SMILES结构式，导入Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.cn/）数据库中，以智人、Probability＞0.3为筛选条件进行靶点预测，从而获得相关靶蛋白，得到生脉饮所含中药有效成分的所有靶点。

1.2慢性心力衰竭疾病靶点的确定

通过在DisGeNET［9］（https：//www.disgenet.org/）数据库，GeneCards［10］（https：//www.genecards.org/）数据库，DrugBank［11］（https：//go.drugbank.com/）数据库和TTD［12］（http：//db.idrblab.net/ttd/）数据库中以“chronic heart failure”为检索词，将其得到的靶点合并去重之后，获得慢性心力衰竭主要涉及的靶点。

1.3“药物-活性成分-疾病作用靶点”网络的构建

通过Venny 2.1.0（http：//bioin fogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）软件对检索所得靶点数据求交集，获得生脉饮（党参方）-慢性心力衰竭的共同靶点。之后以获得的共同靶点构建相应的数据表，以构建的数据表作为Cytoscape 3.7.1的输入文件构建药物-活性成分-疾病作用靶点网络图。

1.4蛋白互作（PPI）网络的构建

将生脉饮（党参方）-慢性心力衰竭的共同靶点导入STRING（https：//string-db.org/）数据库，限制物种为“Homo sapiens”，设置节点combine score≥0.4，同时隐藏孤立的靶点蛋白，获取蛋白互作关系数据，将得到的TSV格式数据导入Cytoscape 3.7.1软件进行可视化处理，通过Network Analyzer工具进行网络分析，绘制PPI网络图［13］。选择Cytoscape 3.7.1插件Cyto NCA对PPI网络进行拓扑分析同时计算各节点的介数，接近中心性和子网络中心性，以其叠加平均值为界限筛选出关键靶点，并以相同的方法得到核心靶点。

1.5基因本体（GO）生物学分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析

运用R语言 “clusterProfiler”“ggplot2”等軟件程序包，对网络构建获得的药物-疾病交集靶点进行GO和KEGG分析，并使用柱状图、气泡图等进行可视化分析，以P＜0.05为界限，将其按照升序排列展示居前20位GO生物过程和KEGG代谢通路。

1.6基因表达综合数据库（GEO）芯片验证

在GEO数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov-s.dres.hactcm.edu.cn/geo）中以“chronic heart failure”为检索词，检索相关数据集。下载慢性心力衰竭基因表达矩阵和平台注释文件，使用平台进行log2化处理，使用R语言“preprocessCore”包进行标准化处理，对于不同探针对应的重复基因计算其平均值作为最终表达量，剔除没有匹配到基因的探针。之后采用R语言“limma”包去除批次效应，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）评估批次效应是否去除。最后，使用R语言“ggplot2”“ggpubr”包绘制核心靶点的基因表达箱式图，观察核心靶点基因表达差异情况。

1.7分子对接

根据以上分析结果，查阅文献，选取度值（Degree值）排名居前6位的药物有效成分，通过Cytoscape插件Cyto NCA筛选得到的10个核心靶点依次进行分子对接。从PubChem网站获取各有效成分的2D结构，之后使用Openbabel软件将其转化为PDB格式。通过PDB（https：//www.rcsb.org/）数据库下载核心靶点的蛋白结构。在进行分子对接之前对其进行去水、加氢等预处理，之后将其导入AutodockTools 1.5.7软件和Autodock Vina软件进行分子对接，计算化合物与核心靶点的结合能，并使用PyMOL软件进行可视化［14］。

2结果

2.1生脉饮相关中药有效成分收集及靶点预测

经检索发现，党参含有14个成分，五味子含有8个成分，麦冬含有16个成分，合并去重之后生脉饮共含有35个化学成分，同时收集其作用靶点，之后通过UniProt（https：//www.uniprot.org/）數据库进行名称标准化，将各有效成分靶点合并去重之后得到 374个靶点，具体化学成分信息见表1。

2.2慢性心力衰竭疾病靶点的筛选

通过在DisGeNET数据库、GeneCards数据库、DrugBank数据库和TTD数据库中以“chronic heart failure”为检索词获得疾病靶点，将各数据库靶点合并去重之后，共得到1 500个疾病靶点。

2.3中药-成分-疾病-靶点网络的构建

通过韦恩图发现，生脉饮（党参方）和慢性心力衰竭共同靶点黑色部分共有120个，紫色部分为药物靶点，共374个；黄色部分为疾病靶点，共1 500个。详见图1。使用交集靶点构建中药-成分-疾病-靶点网络，网络中化合物与靶点之间的连线数目称为自由度（Degree）值，自由度越高表明其作用靶点越多。图2中棕色方块代表五味子及其化学成分，绿色菱形代表党参及其化学成分，蓝色三角代表麦冬及其化学成分，紫色圆形代表交集基因靶点，红色形状代表慢性心力衰竭。进行拓扑分析，发现Degree值排名居前6位的化合物依次为菠菜甾醇、11-羟基兰金断肠草碱、α菠菜甾醇、邻苯二甲酸二异辛酯、黄豆黄素、去氧哈林通碱。

2.4PPI的构建及核心靶点筛选

通过韦恩图可观察到交集靶点共120个，将其输入STRING数据库进行PPI分析，得到PPI，之后导入Cytoscape 3.7.1进行可视化处理，该网络图共有118个节点，Degree值平均为37.2，接近中心性（closeness）平均值为0.58，中介中心性（betweenness）平均值为0.032 1，节点颜色越深证明Degree值越高，线条粗细及颜色深度同样代表度值大小，之后利用Cytoscape 3.7.1中的CytoNCA插件以点度中心性Degree值，接近中心性、中介中心性的叠加平均值为界限进行关键靶点的筛选，并以相同的方法进行核心靶点的筛选［15］。得到生脉饮治疗慢性心力衰竭的核心靶点分别为丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT1）、非受体酪氨酸激酶（SRC）、表皮生长因子受体（EGFR）、热休克蛋白（HSP90AA1）、前列腺素内过氧化物合酶 2（PTGS2）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、上皮剪接调节蛋白1（ESR1）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARG）、Toll样受体4、内皮型一氧化氮合酶（NOS3）。详见图3。

2.5GO富集和KEGG通路分析

将交集基因通过R语言程序包进行GO和KEGG分析，并依据P＜0.05升序展示前20条通路，GO富集分析共包括2 350个分析条目，包括2 044个生物过程（biological process，BP）分析条目，主要涉及肽基酪氨酸修饰、氧化应激、丝裂原活化蛋白激酶、调节血液循环等生物过程；112个细胞组分（cellular components，CC）分析条目，主要包括神经细胞体、囊泡腔、突触前膜等细胞组成；194个分子功能（molecular functions，MF）分析条目，主要包括蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、生长因子结合等分子功能。KEGG分析共包含158条通路，主要集中在脂质和动脉粥样硬化、松弛素、前列腺素、雌激素、糖尿病并发症等信号通路。详见图4、图5。

2.6GEO芯片验证

在GEO数据库下载GSE21125数据集，该数据集是由Smih等［16］进行的不同心力衰竭阶段的转录组分析，包括健康组、心力衰竭风险组、无症状左心室功能障碍组、慢性心力衰竭组、急性心力衰竭组，每组包含9个样本。本研究选取健康组及慢性心力衰竭组进行分析验证，通过R语言软件包对其进行标准化，去除批次效应等处理，之后绘制核心靶点的基因表达箱式图。AKT1、SRC、EGFR、HSP90AA1、PTGS2、MMP-9、ESR1、PPARG、TLR4、eNOS在健康组与慢性心力衰竭疾病组之间基因表达存在差异，其中AKT1、MMP-9、PPARG、SRC、PTGS2差异较为显著。详见图6。

2.7分子对接

通过查阅文献综合判断，选取10个核心靶点与药物-化合物-疾病-靶标网络中Degree值排名居前6位的有效成分进行分子对接。当结合自由能小于－20.92 kJ/mol时代表结合能力较好。结果显示，有效成分和核心靶点整体结合情况较好。其中，菠菜甾醇与AKT1结合能为－34.77kJ/mol，菠菜甾醇与MMP-9结合能为－40.04kJ/mol，11-羟基兰金断肠草碱与MMP-9结合能为－34.35 kJ/mol、α菠菜甾醇与MMP-9的结合能为－37.99 kJ/mol，绝对值位于前4位，因此将其对接结果通过Pymol软件进行可视化，并将其余对接结果通过R语言“heatmap”包绘制热图展示。详见图7、图8。

3讨论

慢性心力衰竭病因病机较为复雜，临床医家大多认为心气亏虚、营血不足为病机之本，瘀血阻滞、痰饮内停为病机之标［17］。主要包括气虚血瘀、气阴两虚、阳虚水泛、喘脱危证等［18］。调查显示，气阴两虚证是慢性心力衰竭最常见的双因素合并虚证［19］。生脉饮（党参方）由《医学启源》中人参方演变而来，临床应用比后者更为广泛，但其具体作用机制的研究却较为缺少，具有健脾益肺、养血生津的功效，广泛应用于慢性心力衰竭气阴两虚证的治疗，并且取得显著效果［20-22］。

本研究通过网络药理学方法探讨生脉饮（党参方）治疗慢性心力衰竭的潜在有效化学成分及靶点，并通过GEO芯片和分子对接进行初步验证，最终得到35个有效化学成分及120个生脉饮（党参方）-慢性心力衰竭交集靶点和20条信号通路，并构建中药-成分-疾病-靶点网络和PPI蛋白互作网络，在35个化学成分中，菠菜甾醇、11-羟基兰金断肠草碱、α菠菜甾醇、邻苯二甲酸二异辛酯、黄豆黄素、去氧哈林通碱与潜在靶点的关联度最高，可能是生脉饮治疗慢性心力衰竭的药效物质基础，之后通过Cytoscape软件对PPI蛋白互作网络进行核心靶点的筛选，发现AKT1、SRC、EGFR、HSP90AA1、PTGS2、MMP-9、ESR1、PPARG、TLR4、eNOS可能在治疗慢性心力衰竭方面发挥重要作用。

AKT 是一类 AGC 家族的丝氨酸/苏氨酸激酶，其在PI3K-AKT信号通路中发挥关键作用，主要包括3种异构体AKT1、AKT12、AKT3，其中AKT1在组织中广泛表达［23］。有研究表明，将AKT1转染至心脏后能缩小心肌梗死灶面积，明显减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡［24］。SRC通过参与多条信号通路，如细胞增殖、迁移、肿瘤的发生等，来有效减慢心肌纤维化的进程［25］。EGFR是一种络氨酸激酶，可以作用于血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）受体，促进心肌细胞有丝分裂，对于心脏功能的成长及发育起着至关重要的作用［26］。HSP90属于热休克蛋白家族的一个亚组，可以影响与心力衰竭相关的40余种蛋白激酶，并且与AKT相互作用并激活eNOS3，调节一氧化氮的生成，改善心脏血管状态和血流供应［27］。PTGS2是血栓形成的潜在靶标，不仅可以降低血液黏度，而且可以调控肝星状细胞的凋亡，减缓肝纤维化进程［28-29］。MMP-9是基质金属蛋白酶的一种亚型，其增强表达可以有效改善心力衰竭的重要病理改变过程，即心肌重塑［30］。ESR1是雌激素受体，其可诱导促血管内皮细胞生长因子VEGFA来增强血管生成，减少炎症反应，对于改善心脏脂肪组织的功能具有重要意义［31］。

将交集靶点进行GO富集分析，发现其生物过程主要富集在MAPK、调节血液循环、氧化应激、酪氨酸磷酸化修饰方面。丝裂原激活蛋白激酶MAPK存在于大部分细胞中，通过多种病理过程，如细胞增殖、凋亡等来参与心肌重塑过程，调控心肌细胞肥大［32］。KEGG富集分析结果显示其信号通路主要包括PI3K-AKT、EGFR酪氨酸激酶、雌激素信号通路、脂质及动脉粥样硬化等方面。PI3K-AKT信号通路是调节心肌细胞凋亡和心肌重塑过程的主要信号通路之一，PI3K通过作用于其下游靶点AKT，从而促进营养吸收、代谢、细胞生长等［33］。有研究表明，EGFR通路的激活可以上调相关基因的表达，维持心肌结构的稳定性，改善重塑，例如由分泌型磷脂酶A2-ⅡA 介导的EGFR通路激动可以增强心肌成纤维细胞中AKT的磷酸化水平等［34］。

GEO芯片验证结果显示，最终筛选出来的核心靶点在健康组与疾病组中的基因表达量存在明显差异，说明这些靶点及参与的相关通路如PI3K-AKT、脂质及动脉粥样硬化等信号通路，可能在慢性心力衰竭疾病发生发展过程中发挥作用。分子对接结果显示，有效成分和核心靶点整体结合情况较好，其中，菠菜甾醇与AKT1、菠菜甾醇与MMP-9、11-羟基兰金断肠草碱与MMP-9、α菠菜甾醇与MMP-9 具有较强的结合性。

4小结

综上所述，本研究通过网络药理学结合生物信息学分析，发现生脉饮（党参方）可能通过调控AKT1、SRC、EGFR、HSP90AA1、MMP-9等靶点参与MAPK、调节血液循环、氧化应激、酪氨酸磷酸化修饰等生物过程，调控PI3K-AKT、EGFR酪氨酸激酶、雌激素信号通路、脂质及动脉粥样硬化等信号通路，改善心脏血流供应状态及影响重塑过程，抑制炎症反应来治疗慢性心力衰竭。但以上结果有待进一步进行体内外实验验证，为以后进行临床及基础实验提供参考。

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（收稿日期：2023-01-16）

（本文编辑王雅洁）