腧穴“解郁方”对慢性不可预测轻度应激抑郁大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴及BDNF/TrkB/CREB通路的影响

王文瑞，韩文华，董爱爱，王维峰

摘要目的：觀察腧穴“解郁方”对慢性不可预测轻度应激（CUMS）抑郁大鼠下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴和脑源性神经营养因子（BDNF）/酪氨酸激酶B受体（TrkB）/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）信号通路的影响。方法：40只无特定病原体（SPF）级Sprague Danley（SD）雄性大鼠随机分为空白组（10只）、模型组（10只）、西药组（10只）、针刺组（10只），除空白组外，其余3组连续28 d 构建CUMS抑郁大鼠模型，造模成功后，西药组连续14 d灌胃盐酸帕罗西汀混悬液，每日1次；针刺组针刺百会、太冲、神门，每日1次，每次20 min，连续针刺14 d。苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠海马病理变化，酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质醇（CORT）水平；免疫组化（IHC）检测海马BDNF、TrkB表达情况，蛋白质免疫印迹法（Western Blot）及实时荧光定量-聚合酶链式反应（PCR）测定海马BDNF、TrkB、CREB蛋白及mRNA的表达。结果：与空白组比较，模型组血清CRH、ACTH和CORT含量上升（P＜0.01），海马病理损伤严重，海马BDNF、TrkB平均光密度降低（P＜0.01），BDNF、TrkB、CREB蛋白及mRNA明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，针刺组血清CRH、ACTH、CORT含量下降（P＜0.05），海马病理损害明显减轻，BDNF、TrkB平均光密度明显增加（P＜0.05），BDNF、CREB、TrkB蛋白及mRNA表达水平上升（P＜0.05）。结论：腧穴“解郁方”可能通过调节HPA轴和调控BDNF/TrkB/CREB信号通路，改善CUMS诱导的大鼠抑郁样行为。

关键词抑郁症；慢性不可预测轻度应激；腧穴“解郁方”；下丘脑-垂体-肾上腺轴；脑源性神经营养因子/酪氨酸激酶B受体/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白信号通路；海马；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.08.011

Effects of Acupuncture "Jieyu Formula" on Hypothalamic-pituitary-adrenal Axis and BDNF/TrkB/CREB Pathway in Rats with Chronic and Unpredictable Mild Stress-induced Depression

WANG Wenrui， HAN Wenhua， DONG Aiai， WANG Weifeng

The Second Clinical College of Shanxi Medical University， Jinzhong 030619， Shanxi， China

Corresponding AuthorWANG Weifeng， E-mail： dzywwf@163.com

AbstractObjective：To observe the effects of "Jiyu Formula" on the hypothalamic-pituitary-adrenal（HPA） axis and  brain-derived neurotrophic factor（BDNF）/tyrosine kinase B receptor（TrkB）/cyclic adenosine phosphate reaction element binding protein（CREB） signaling pathway on chronic and unpredictable mild stress（CUMS） depressed rats.Methods：Forty specific pathogen free（SPF） grade SD male rats were randomly divided into blank group（10 rats），model group（10 rats），western medicine group（10 rats），and acupuncture group（10 rats）.Except for the blank group，the other three groups were continuously used to construct a depression rat model by CUMS for 28 days.After successful modeling，the western medicine group was gavaged Paxil hydrochloride suspension once a day for 14 days.In the acupuncture group，Baihui，Taichong and Shenmen were acupunctured once a day for 20 minutes each time for 14 days.The pathological changes of hippocampus were detected by hematoxylin-eosin（HE） staining，and the levels of serum adrenocorticotropin releasing hormone（CRH），adrenocorticotropin（ACTH） and cortisol（CORT） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expressions of BDNF and TrkB in hippocampus were detected by immunohistochemistry（IHC），and the expressions of BDNF，TrkB and CREB protein and mRNA in hippocampus were detected by Western Blot and real-time fluorescence quantification and polymerase chain reaction（PCR）.Results：Compared with blank group，the contents of serum CRH，ACTH and CORT in the model group significantly increased（P＜0.01），the hippocampal pathological injury was serious，the average optical density of BDNF and TrkB in hippocampus significantly decreased（P＜0.01）.The protein and mRNA levels of BDNF，TrkB，and CREB were significantly decreased（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with model group，the contents of serum CRH，ACTH and CORT in the acupuncture group significantly decreased（P＜0.05），the hippocampal pathological injury was significantly alleviated，the average optical density of BDNF and TrkB significantly increased（P＜0.05） The protein and mRNA levels of BDNF，TrkB，and CREB were significantly increased（P＜0.05）.Conclusion：Acupuncture "Jieyu Formula" could improve depression-like behavior induced by CUMS in rats by regulating HPA axis and BDNF/TrkB/CREB signaling pathway.

Keywordsdepression; chronic unpredictable mild stress; acupoint "Jieyu Formula"; hypothalamic-pituitary-adrenal axis; brain-derived neurotrophic factor/tyrosine kinase B receptor/cyclic adenosine phosphate reaction element binding protein signaling pathway; hippocampus; experimental study

抑郁癥（depression）是一组精神障碍疾病，主要表现为情绪不振、缺乏快感、思维迟钝、认知功能减退、睡眠障碍等临床症状［1］。根据相关报道，抑郁症已经被确认成为一种迅速增加的流行病，预计将成为2030年全球疾病负担的主要疾病之一［2］。目前，临床上广泛应用于抑郁症治疗的药物有选择性单胺递质再摄取抑制剂，如盐酸帕罗西汀，虽然可以缓解部分抑郁症症状，但这类药物主要在单胺系统中发挥作用，作用部位比较单一，其受长期服用、副作用大、病人难以坚持等问题的制约［3］，只有40%～50%的抑郁症状可以缓解［4］。

针灸逐渐成为治疗抑郁症的一种重要替代疗法，这在世界范围内已得到普遍认可［5］。临床研究及动物实验均显示，针刺治疗抑郁症效果颇佳［6-7］。现代研究表明，针刺可通过多层次、多靶点、多系统对抑郁症及其兼症起到很好的调节作用［8］。针刺治疗抑郁症临床疗效明显，尚需进行规范处方下的多重机制研究。本课题组前期经过筛选之后发现针刺治疗抑郁症的有效腧穴组方为百会、神门、太冲（简称腧穴“解郁方”［9］）。有研究发现腧穴“解郁方”能使血清炎性因子和激素水平降低［10］。本研究以下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴和脑源性神经营养因子（BDNF）/酪氨酸激酶B受体（TrkB）/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）信号通路为基础，探讨腧穴“解郁方”抗抑郁的可能作用机制，为腧穴“解郁方”治疗抑郁症提供依据。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器

盐酸帕罗西汀（浙江尖峰药业有限公司生产，国药准字H20040533，批号：220403）；针灸针（苏州医疗用品厂有限公司生产，规格0.35 mm×25 mm，批号：216010）；蔗糖（天津天力化学试剂有限公司，批号：20230402）；伊莱瑞特生产的大鼠促肾上腺皮质激酶释放激素（CRH）试剂盒（批号：KL03TF0J9073）；促肾上腺皮质激素（ACTH）试剂盒（批号：KL02D6206258，伊莱瑞特）；联科生物生产的皮质醇（CORT）酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（批号：A810030323）；RNA提取液（货号：G3013，武汉赛维尔生物科技有限公司生产）；BDNF、TrkB、CREB、β-actin均为一抗、辣根过氧化物酶（HRP）-山羊抗兔（由Servicebio提供）。

自制旷场试验箱（100 cm×100 cm）；大鼠笼及固定板（由山西中医药大学提供）；台式高速冷冻微量离心机（D3024R，DragonLab）；垂直电泳仪（SVE-2，Servicebio）；荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（CFX Connect，Bio-rad）；武汉赛维尔生物科技有限公司生产的涡旋混匀仪（货号SMV-3500）；电子天平［型号ME203E/02，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；酶标检测仪（型号Epoch，BioTeK生产）。

1.2动物

在山西中医药大学科研楼实验室饲养的实验动物，使用北京斯贝福有限公司提供的无特定病原体（SPF）级Spragu Dowley（SD）雄性大鼠40只，体质量130～150 g，许可证号为SCXK（京）2019-0010，标准鼠笼，饲养环境温度维持在22～25 ℃，相对湿度控制在45%～50%，光照周期为12 h/12 h，日温差≤4 ℃，大鼠在饲养期间自由活动、饮水、摄食。动物实验经山西中医药大学伦理委员会批准，伦理批号：2021DW175。实验过程中符合国家和学校有关实验动物的管理和使用规定。

1.3方法

1.3.1模型制备

采用慢性不可预知温应激法（CUMS）制备大鼠抑郁模型［11］，使用刺激方法包括：24 h禁水，24 h禁食，5 min热刺激，5 min 4 ℃冷水游泳，5 min夹尾，24 h倾斜笼具45°，24 h潮湿垫料，每天随机给出1种应激，保证不会连续出现相同的刺激。造模28 d后进行糖水偏好实验（sucrose preference test，SPT）和旷场实验（open field test，OFT）评价模型是否成功建立。

1.3.2动物分组及干预方法

经过1周的适应性饲养，大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组、西药组、针刺组，每组10只。空白组不施加任何应激方式，每笼5只，正常喂养。模型组给予不可预见的28 d应激刺激，单笼饲养。西药组孤养，造模成功后给予盐酸帕罗西汀，给药剂量为3.3 mg/kg，临用时溶于蒸馏水配成混悬液，以1 mL/100 g灌胃给药，每日1次，连续14 d。针刺组孤养，造模成功后，选择燕平教授团队前期通过实验论证治疗抑郁症的最佳穴位组方，即百会、神门、太冲。穴位定位参考《实验针灸学》［12］，针刺治疗从造模第1天开始，留针20 min，每日1次，干预14 d。

1.3.3行为学检测

1.3.3.1蔗糖偏好实验

蔗糖偏好实验是评价抑郁症一个经典核心症状的测试即缺乏快感测试［13］。提前60 h训练大鼠饮用1%的蔗糖溶液：24 h给每只动物2瓶1%的蔗糖溶液，以适应糖水；24 h给予1瓶糖水，1瓶纯净水；之后，大鼠禁食禁水12 h。24 h给予大鼠事先称量的1瓶纯水和1瓶糖水，计算大鼠在24 h内的糖水偏好度。糖水偏好度（%）＝糖水消耗量（g）／糖水消耗量（g）＋纯水消耗量（g）×100%。

1.3.3.2旷场实验

旷场实验是一种评价大鼠自主活动的方法，是评估其在新环境中自主活动、探究行为和紧张程度的一种方法，当活動减少时，表明大鼠的探索行为减少、紧张程度增高，同时抑郁状态也会增加［14］。在安静环境下，将大鼠放入自制的旷场实验箱内（共25格），每只单箱开展实验。实验结束后，记录每只大鼠的水平跨越格数及上肢直立的次数。每只大鼠实验结束后均需清洁实验箱，以免影响实验结果。

1.3.4采用ELISA方法检测血清CRH、ACTH、CORT水平

大鼠采用20%乌拉坦行腹腔注射麻醉，取5 mL腹主动脉血，离心15 min（3 000 r/min），用移液枪将血清移入环氧树脂（EP）管内，在－80 ℃冰箱内保存待测。采用ELISA法检测，按ELISA试剂盒说明书对大鼠血清CRH、ACTH、CORT含量进行检测。

1.3.5用HE染色法观察大鼠海马CA3区细胞形态变化

取血后，行断头取脑术，将脑组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，应用HE染色方法，根据HE染色试剂盒说明书制备石蜡切片，中性树胶密封后，用显微镜观察大鼠海马区的病理变化。

1.3.6免疫组化法检测大鼠海马组织BDNF、TrkB含量

取石蜡切片经脱蜡，根据BDNF、TrkB免疫组化说明书进行操作，经过脱蜡至水、抗原修复、灭活，一抗孵育：滴加BDNF、trkB抗体，37 ℃湿盒孵育2 h，二抗孵育：滴加HRP-山羊抗兔，37 ℃孵育30 min，之后脱水透明封片后，用阳性深浅评价阳性强弱。

1.3.7大鼠海马组织BDNF、TrkB、CREB的蛋白表达水平

蛋白质免疫印迹法（Western Blot）测定海马BDNF、TrkB、CREB的蛋白表达。在海马组织中加入10倍组织体积的裂解液进行匀浆，收集上清液，用二喹啉甲酸法（BCA）测定总蛋白浓度，沸水浴变性15 min，十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，进行转膜后，加上5%的牛奶，按1∶1 000添加配置好的BDNF、TrkB、CREB一抗，隔天用TBST缓冲液快速冲洗膜，滴加稀释后的二抗（1∶5 000），常温孵育30 min，TBST洗膜，曝光保存原始图为TIFF格式，利用Image J软件分析Western Blot 条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.3.8大鼠海马组织BDNF、TrkB、CREB的 mRNA表达水平

实时荧光定量PCR测量BDNF、TrkB、CREB的mRNA表达。用Trizol试剂盒提取研磨组织后的总RNA，检测其浓度及纯度，进行逆转录总RNA为cDNA。用荧光定量PCR仪扩增，计算目的基因相对表达量采用2－ΔΔCt法，以GAPDH为内参，引物名称及序列见表1。

1.3.9统计学处理

统计分析采用SPSS 25.0软件，定量资料符合正态分布且方差齐时，以均数±标准差（x±s）表示，多组比较单因素方差分析，两组数据分析均采用独立样本t检验；定性资料采用例数、百分比（%）表示，采取χ2检验；用Graphpad prism8.0作图。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1腧穴“解郁方”对抑郁大鼠行为学的作用

2.1.1各组大鼠蔗糖偏好度比较

与空白组比较，模型组大鼠糖水消耗量显著降低（P＜0.01），提示CUMS大鼠模型复制成功。针刺组、西药组与模型组相比，糖水消耗量显著提高（P＜0.01）；而西药组和针刺组糖水消耗量差异无统计学意义（P＞0.05），表明腧穴“解郁方”可有效提高大鼠的快感度。详见图1。

2.1.2各组大鼠水平运动及垂直运动得分比较

与空白组比较，模型组大鼠水平运动和垂直运动的得分减少（P＜0.01）；与模型组比较，针刺组、西药组水平运动和垂直运动的得分增加（P＜0.01），西药组和针刺组水平运动、垂直运动得分比较差异无统计学意义（P＞0.05），可见针刺可有效提高抑郁大鼠的自主活动，缓解其紧张度。详见图2。

2.2腧穴“解郁方”对大鼠海马CA3区病理变化的影响

HE染色结果表明，空白组大鼠海马CA3区神经元细胞排列整齐，结构完整；模型组海马CA3区神经元细胞结构不明确，排列松散，存在异常结构；与模型组比较，针刺组海马CA3区神经元数量较模型组明显增加，排列较为整齐，表明大鼠海马神经元的病理损伤可通过腧穴“解郁方”得到改善。详见图3。

2.3腧穴“解郁方”对大鼠海马组织中BDNF、TrkB表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠海马BDNF、TrkB的平均光密度值减少（P＜0.01）；与模型组相比，针刺组、西药组BDNF、TrkB的平均光密度值明显增加（P＜0.05），西药组和针刺组BDNF、TrkB之间的平均光密度值表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）。详见图4、图5。

2.4腧穴“解郁方”对大鼠血清CRH、ACTH、CORT的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清CRH、ACTH、CORT含量增加（P＜0.01）；与模型组比较，针刺组、西药组大鼠CRH、ACTH、CORT含量明显下降（P＜0.05），西药组与针刺组各项含量比较差异无统计学意义。证明腧穴“解郁方”对HPA轴亢进有调节作用。详见图6。

2.5腧穴“解郁方”对抑郁大鼠海马组织BDNF、TrkB、CREB蛋白的影响

与空白组比较，模型组大鼠海马组织中BDNF、TrkB、CREB蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，针刺组、西药组大鼠海马组织中BDNF、TrkB、CREB蛋白表达水平明显增加（P＜0.05）。结果表明，腧穴“解郁方”可提高大鼠海马组织中BDNF、TrkB、CREB蛋白表达，从而改善大鼠的抑郁状态。详见图7、图8。

2.6腧穴“解郁方”对抑郁大鼠海马组织中BDNF、TrkB、CREB mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠海马组织中BDNF、TrkB、CREB mRNA表达水平明显下降（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，针刺组、西药组BDNF、TrkB、CREB mRNA表达水平明显增加（P＜0.05），实验结果表明，腧穴“解郁方”能够增加BDNF、TrkB、CREB mRNA的表达，从而起到缓解大鼠抑郁症状的作用。详见图9。

3讨论

CUMS是一种应激反应，被认为是研究抑郁症病理生理机制的最佳模型［13］，因此，本研究利用CUMS法诱导大鼠抑郁模型，模型组经过CUMS法造模后，糖水偏好度等降低，HE染色结果显示大鼠海马细胞出现溶解现象，细胞排列紊乱，证明CUMS法造模会造成大鼠海马组织的损伤。谢保弟［15］研究显示，腧穴“解郁方”可能通过对抑郁大鼠海马神经细胞的保护作用使海马神经细胞减少相对较少。本研究显示腧穴“解郁方”可使大鼠海马区神经元细胞排列趋于规则，破坏溶解现象减少。

抑郁症是一种常见的精神类疾病，其发病机制错综复杂［16］。本研究从HPA轴失衡和BDNF两个角度阐述抑郁症的相关机制。在抑郁症的发病过程中，HPA轴起着重要的作用［17］。研究表明，HPA轴在应激状态下可被过度激活，导致大量应激激素释放，如CRH、ACTH、CORT等，导致机体负反馈机制受损和紊乱［18］。高水平的应激激素会进一步损害颞叶和海马的结构和功能，引起锥体神经元萎缩和再生功能障碍，最终表现为抑郁症状［19］。本研究ELISA结果显示，模型组大鼠血清中CRH、ACTH、CORT含量显著升高，提示抑郁大鼠发生了HPA轴的失衡。

BDNF属于神经营养因子家族，是一种在前额叶皮层和海马有高度表达的中枢神经系统中分布最广泛的神经营养因子［20］。BDNF能维持情绪和认知功能，对学习和记忆起着至关重要的作用，可以促进轴突生长、树突细胞成熟，提高突触可塑性［21］。BDNF启动一系列下游信号转导过程，与TrkB受体高亲和力结合后，通过促进神经元的生存、发育、生长和分化，起到调节神经系统突触可塑性和神经再生的作用，达到抗抑郁的作用［22］。巴戟天可通过BDNF/TrkB/CREB信号通路對抑郁大鼠海马神经元损伤发挥神经保护作用，改善抑郁行为［23］；电针可通过增加海马组织型纤溶酶原激活物（tPA），激活BDNF/TrkB通路从而起到抗抑郁作用［24］；激活BDNF/TrkB/CREB通路可改善脑卒中后抑郁大鼠的抑郁样行为［25］。以上研究均说明BDNF/TrkB/CREB通路在抑郁症中发挥重要作用。

在腧穴“解郁方”中，百会位于头部，是督脉与足太阳之会，具有开窍醒神，调节阴阳之效；神门穴为手少阴心经原穴，气血输注之处，可起到安定心神、调节气血的作用；太冲为足厥阴肝经之原穴，具有调畅气机的作用，与情绪调节功能有着密切的联系。三穴相配，上中下共调，可达到调和阴阳、疏肝解郁、安神定志的功效，进而达到治疗抑郁症的目的。乔瑞瑞［26］研究显示，腧穴“解郁方”可降低大鼠血清中ACTH、CORT的含量，起到治疗抑郁作用；李佳豪等［27］研究显示，腧穴“解郁方”通过激活与BDNF相关信号通路，改善大鼠抑郁行为。CUMS法诱导的大鼠海马组织BDNF、TrkB、CREB蛋白含量及mRNA表达水平降低，经腧穴“解郁方”干预后，BDNF、TrkB、CREB蛋白含量及mRNA表达水平上升，可能与调节BDNF/TrkB/CREB信号通路有关。

综上所述，腧穴“解郁方”可能通过拮抗HPA轴失衡及调节BDNF/TrkB/CREB信号通路，从而改善抑郁大鼠的抑郁样行为。

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（收稿日期：2023-10-21）

（本文编辑王雅洁）