PCSK9抑制剂依洛尤单抗对冠心病大鼠血脂、血管内皮功能损伤及炎性因子的影响

乔福斌，甄胜达，张娜，李仕娴，乔鑫，张成军

摘要目的：探究前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型（PCSK9）抑制剂依洛尤单抗对冠心病（CHD）大鼠血脂、血管内皮功能损伤及炎性因子的影响。方法：通过高脂饮食构建CHD大鼠模型，建模成功的45只大鼠随机分为CHD组、依洛尤单抗20组和依洛尤单抗40组，每组15只；15只正常大鼠作为对照组。依洛尤单抗20组和依洛尤单抗40组分别皮下注射依洛尤单抗20 mg/kg与40 mg/kg。2周后检测各组心肌组织、血脂指标、血管内皮功能指标和炎性因子水平。结果：与对照组大鼠比较，CHD组大鼠心肌组织损伤、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β、内皮素（ET）-1水平显著升高，一氧化氮水平顯著降低（P＜0.05）。依洛尤单抗20组和依洛尤单抗40组一氧化氮显著高于CHD组，其余指标均低于CHD组（P＜0.05）。依洛尤单抗40组的一氧化氮水平高于依洛尤单抗20组，其余指标均低于依洛尤单抗20组（P＜0.05）。结论：依洛尤单抗可抑制血脂和胆固醇水平，保护CHD大鼠心肌组织，并抑制炎症反应，保护血管内皮细胞功能。

关键词冠心病；前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型，PCSK9；依洛尤单抗；血脂；内皮功能；炎症反应

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.08.013

高胆固醇血症被认为是冠心病（coronary heart disease，CHD）的重要危险因素，他汀类药物虽然可以调控血脂并降低CHD病人死亡率，但是有50%～80%的病人在治疗后仍未达到正常的胆固醇值［1-2］。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）的突变与高胆固醇血症的发生有关，PCSK9基因多态性与普通人群中血清总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平相关，且与冠心病密切相关［3］。依洛尤单抗是一种针对PCSK9的全人源单克隆IgG2抗体，有临床研究显示，依洛尤单抗使LDL-C水平病人降低了64%～81%［4］。依洛尤单抗能够抑制CHD胆固醇指标促进血脂指标的改善［5］。但是使用依洛尤单抗单独治疗CHD的疗效仍需要充足证据支持。本研究分析依洛尤单抗对CHD大鼠血脂、血管内皮功能损伤及炎性因子的影响。

1材料与方法

1.1实验材料

无特定病原体（SPF）级SD大鼠，雄性，6周龄，210～230 g，北京科兴中维生物技术有限公司，SYXK（京）2020-0054。CM5型自动生化分析仪（微纳芯科技，天津）；Model 680型酶标仪（Bio-Rad公司，美国）；酶联免疫吸附法（ELISA）和苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（碧云天，中国）；TRIzol（Sigma公司，美国）；RNAspin Mini（GE Healthcare，美国）；Bestar qPCR RT和BestarTMqPCR试剂盒（DBI Bioscience公司，德国）；抗体、一抗和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶1 000稀释，＃ab6721）（Abcam公司，美国）；硝酸纤维素膜（EMD Millipore，美国）；增强型化学发光（ECL）显色试剂盒（Thermo Fisher公司，美国）。

1.2动物分组与建模

SD大鼠适应性饲养1周，室温为（24±2）℃，湿度（50±3）%，喂养高脂饲料连续8周，每日30 g。8周后通过检测TC和LDL-C的水平验证建模结果。将建模成功的45只大鼠随机分为CHD组、依洛尤单抗20组（依洛尤单抗皮下注射20 mg/kg，连续2周［6］）和依洛尤单抗40组（依洛尤单抗皮下注射40 mg/kg，连续2周），每组15只；15只正常大鼠作为对照组。

1.3检测指标与方法

1.3.1HE染色

大鼠安乐死，心肌组织在室温下用4%多聚甲醛固定6 h。用乙醇脱水（从低浓度到高浓度）后将组织包埋在石蜡中。然后将石蜡包埋的组织切成5 μm切片，将切片固定于载玻片上。将载玻片在室温下放入苏木精中染色10 min。用自来水洗涤1～2 min后，将玻片置于10%冰醋酸中10 s，然后置于1%氨水中，直到切片变蓝。随后用自来水清洗1～2 min后，将玻片放入曙红中10 s。在乙醇（浓度分别为70%、90%、95%和100%）中脱水后，将玻片置于二甲苯中2 min，重复此步骤1次。最后，用中性胶密封玻片，在倒置显微镜下观察载玻片。

1.3.2血脂指标

收集大鼠尾静脉血5 mL，通过生化分析仪检测TC、三酰甘油（TG）和LDL-C水平。

1.3.3内皮功能指标与血清炎性因子

收集大鼠5 mL尾静脉血静置（室温20 min）、离心（4 ℃ 20 min，2 000 r/min）后使用移液枪小心吸取血清，加入抗体孵育2 h后加入显色剂，10 min后终止反应。试剂盒来自碧云天公司。在450 nm波长下检测吸光度，根据试剂盒标准曲线计算白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β、内皮素（ET）-1和一氧化氮浓度。

1.4统计学处理

使用SPSS 19.0软件分析数据。符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较进行单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1依洛尤单抗对CHD大鼠心肌组织的影响

对照组大鼠细胞核饱满，细胞质染色均匀，细胞有序排列。CHD组大鼠心肌细胞染色不均匀，排列紊乱。依洛尤单抗20组和依洛尤单抗40组染色较CHD组均匀，且依洛尤单抗40组心肌细胞排列基本有序。详见图1。

2.2依洛尤单抗对CHD大鼠血脂的影响

CHD组TC、TG和LDL-C水平高于对照组（P＜0.05），依洛尤单抗20组和依洛尤单抗40组TC、TG和LDL-C水平低于CHD组（P＜0.05），依洛尤单抗40组低于依洛尤单抗20组（P＜0.05），且TC和LDL-C的水平基本恢复至对照组水平。详见表1。

2.3依洛尤单抗对CHD大鼠内皮功能指标的影响

CHD组ET-1高于对照组，一氧化氮低于对照组（P＜0.05）；依洛尤单抗20组和依洛尤单抗40组ET-1低于CHD组，一氧化氮高于CHD组（P＜0.05），依洛尤单抗40组ET-1低于依洛尤单抗20组，且与对照组水平差异不明显，一氧化氮高于依洛尤单抗20组（P＜0.05）。详见表2。

2.4依洛尤單抗对CHD大鼠炎性因子的影响

CHD组TNF-α、IL-1β和IL-6高于对照组（P＜0.05）；依洛尤单抗20组和依洛尤单抗40组低于CHD组（P＜0.05），依洛尤单抗40组的TNF-α、IL-1β和IL-6水平低于依洛尤单抗20组（P＜0.05）。详见表3。

3讨论

他汀类药物是调节血脂治疗CHD的最主要药物，但有研究发现他汀类药物剂量每增加1倍，LDL-C浓度只会额外降低 6%［7］。又由于较高的LDL-C水平是CHD发生和进展的重要因素［8］，因此，在控制血脂的同时有效控制胆固醇对治疗CHD具有关键作用。PCSK9蛋白是由位于染色体1p32.3基因编码的692个氨基酸组成，PCSK9 在内质网中对其N端前段进行分子内自催化裂解并成熟［9］。PCSK9主要在肝脏中表达，在神经元组织、肾间充质细胞和肠上皮细胞中也有表达，PCSK9通过破坏低密度脂蛋白受体的再循环来调节低密度脂蛋白的清除和胆固醇代谢，研究显示PCSK9分子与低密度脂蛋白受体的表皮生长因子样重复序列A结构域结合，从而诱导低密度脂蛋白受体内化到肝细胞中，并随后被溶酶体降解［10］。PCSK9也可充当细胞内分子伴侣，并抑制低密度脂蛋白受体过早形式和向细胞表面膜的转运［11］。作为PCSK9抑制剂，依洛尤单抗是一种新型的治疗心血管粥样硬化和高胆固醇血症的药物，一项单中心的临床研究结果显示，依洛尤单抗可控制血脂指标［12］。本研究通过高脂饮食构建了CHD大鼠模型，并通过依洛尤单抗干预，结果显示依洛尤单抗可剂量依赖性抑制TC、TG和LDL-C，其中高剂量组的TC和LDL-C水平可基本恢复至正常水平，这提示依洛尤单抗在控制血脂特别是胆固醇中有着优秀的作用。冠状动脉负责心肌供血，本研究也检测了心肌组织的变化，结果显示依洛尤单抗可剂量依赖性保护心肌组织，依洛尤单抗可以降低血脂和胆固醇水平，从而缓解CHD心肌损伤。

TC、LDL-C等升高会直接引起血管内皮细胞的氧化应激反应，从而引起炎性反应，促进TNF-α以及IL-1等炎性因子释放［13］。炎性因子不但会促进动脉斑块的形成，还会影响内皮细胞的存活和正常功能，影响冠状动脉功能［14］。一氧化氮和ET-1分别具有舒张和收缩血管的功能，是反映血管内皮细胞功能的指标［15］。研究显示ET-1的降低和一氧化氮的升高是CHD病人预后良好的重要指标［16］。为进一步研究依洛尤单抗对CHD的影响，本研究检测了炎性因子和血管内皮损伤因子。结果显示，CHD模型大鼠外周血中的炎性因子和ET-1显著升高，而一氧化氮降低，使用依洛尤单抗可抑制炎性因子和ET-1的水平，并促进一氧化氮的升高。此外，依洛尤单抗40组的ET-1水平降低至正常水平。有体外研究显示，依洛尤单抗可保护人类内皮细胞免受过氧化氢诱导的氧化应激损伤［17］；也有研究显示依洛尤单抗可促进血管内皮细胞体外血管生成［18］。本研究结果显示，依洛尤单抗可以抑制炎性反应，并保护血管内皮细胞的功能。但是依洛尤单抗保护血管内皮细胞功能与其控制血脂和胆固醇的机制是否有关，是否还有其他调控途径，仍需要进一步在分子学上研究明确。

综上所述，依洛尤单抗可抑制血脂和胆固醇指标保护CHD大鼠心肌组织，并抑制炎症反应保护血管内皮细胞功能。

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（收稿日期：2022-02-11）

（本文編辑王雅洁）