单宁酶对核桃内种皮酚类物质含量的影响

胡文朝　刘雪薇　郑雄　姚佩　史单华　刘群龙　张小军

摘 要：【目的】探究单宁酶处理对核桃内种皮酚类物质含量的影响，为合理开发和利用核桃内种皮提供科学依据。【方法】以‘寒丰核桃内种皮为试验材料，进行单宁酶体外酶解试验，测定分析不同酶解时间、底物浓度、酶添加量下内种皮酚酸、黄酮类等酚类物质含量变化。【结果】添加单宁酶能有效分解内种皮酯型儿茶素ECG，增加非酯型儿茶素EGC、EC含量与没食子酸含量；单宁酶处理能明显降解涩味物质鞣花酸，同时显著提高绿原酸含量。【结论】分解酯型儿茶素、增加非酯型儿茶素与没食子酸的最优工艺为酶解时间5 h、底物浓度20 mg/mL、酶添加量1.2 mg/mL；提取绿原酸与降解鞣花酸的最优工艺为酶解时间1 h、酶添加量1.2 mg/mL、底物浓度10 mg/mL。

关键词：核桃内种皮；单宁酶；黄酮类；绿原酸；鞣花酸

文章编号：2096-8108（2024）03-0036-06 中图分类号：S664.1中图分类号 文献标识码：A文献标志码

The Effect of Tannase on the Content of Phenolic Substances in Walnut Kernel Pellicle

HU  Wenzhao，LIU  Xuewei，ZHENG  Xiong，YAO  Pei，SHI  Danhua，LIU  Qunlong，ZHANG  Xiaojun*

（College of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taigu Shanxi 030801， China）

Abstract： 【Objective】To explore the effect of tannase treatment on the content of phenolic substances in walnut kernel pellicle and to provide scientific basis for rational development and utilization of walnut kernel parnel.【Methods】In this study， the kernel pellicle of ‘Hanfeng walnut was used as experimental material to conduct in vitro tannaseenzymolysis test， and the contents of phenolic substances such as phenolic acid and flavonoid were determined and analyzed under different enzymolysis time， substrate concentration and enzyme addition amount. 【Results】The addition of tannase could effectively decompose the ester-type catechin ECG of endotesta， increase the content of non-ester-type catechin EGC， EC and gallic acid. Tannase treatment could significantly degrade ellagic acid and increase the content of chlorogenic acid.【Conclusion】The optimal process for the decomposition of ester catechins and the increase of non-ester catechins and gallic acid are enzymatic hydrolysis time of 5 h， substrate concentration of 20 mg/mL， and enzyme addition of 1.2 mg/mL. The optimal process for extractionof chlorogenic acid and degrading of ellagic acid are enzymatic hydrolysis time of 1 h， enzyme addition of 1.2 mg/mL， and substrate concentration of 10 mg/mL.

Keywords：walnut kernel pellicle; tannase; flavonoids; chlorogenic acid; ellagic acid

核桃為胡桃科胡桃属植物，又名胡桃、羌桃，是世界著名的“四大干果”之一［1］。核桃仁营养丰富，含有脂肪、蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质等营养物质［2］。核桃内种皮中的酚类物质含量较核桃仁更为丰富，主要包括类黄酮、苯醌、酚酸等活性成分，具有良好的抗氧化活性，有延缓人体衰老、健脑益智、降血糖、抗癌、抑菌等多方面功效［3-4］。

单宁酶又称单宁酯酰水解酶或鞣酸酶，是由微生物在单宁酸存在的条件下诱导合成的一种细胞膜结合酶，可催化没食子单宁、复合单宁与没食子酸酯等化合物中酯键的水解，释放没食子酸［5-6］。单宁酶作为安全产品，多被用于脱除果实、茶饮品等中因单宁物质产生的苦涩味，也可作为澄清剂改善饮料的外观色泽与储藏过程中产生的浑浊问题［7-9］。同时，单宁酶还会影响绿茶、花生种衣等水解物中酚类物质含量，提高其抗氧化活性［8，10］。黄玉凤等［10］研究发现在绿茶水浸出物中添加单宁酶，可有效分解其酯型儿茶素（EGCG、GCG、ECG），并显著提高浸出物对DPPH、ABTS自由基的清除能力。王君等［11］将单宁酶作用于新鲜牛蒡，发现牛蒡提取物中多酚含量及其抗氧化活性均显著提高。但目前未见有利用单宁酶处理核桃内种皮提取液的研究。本研究以‘寒丰核桃成熟果实内种皮为试验材料，通过酶解时间、底物浓度、酶添加量等单因素试验，研究单宁酶对核桃内种皮酚类物质含量的影响，为合理开发和利用核桃内种皮提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为‘寒丰核桃成熟果实内种皮，试验植株栽植于山西农业大学核桃种质资源圃。于2022年9月从生长健壮、长势一致的植株树冠外围采摘发育成熟、无病虫害的果实500个。将采回的鲜核桃迅速剥去青皮和硬壳，用镊子取下核桃仁外的薄膜，冷冻干燥后于－80℃条件下保存备用。

1.2 试验方法

将冷冻干燥后的核桃内种皮粉碎，称取不同量的内种皮粉末置于50mL离心管中，加入25mL超纯水，超声浸提30min后，根据内种皮与酶制剂的比例要求加入不同量的单宁酶；对照不加单宁酶，其他条件相同。设3次重复。酶解后95℃水浴5min灭活单宁酶，待温度降低到室温后，10 000 r· min-1离心 10 min，取上清液，定容，待HPLC测定。试验采用单因素试验设计。

1.2.1 单因素试验

1）酶解时间：称取0.5g内种皮加25mL超纯水，超声浸提30min后，加入0.05g单宁酶，在50℃水浴锅中反应1、2、3、4、5h，测定内种皮中酚类物质（酚酸、黄酮类）的含量。对照为不添加单宁酶，其他条件相同。

2）底物浓度：称取0.25、0.5、1、1.5g内种皮加25mL超纯水，底物浓度分别为10、20、40、60mg/mL，超声浸提30min后，加入0.05g单宁酶，在50℃水浴锅中反应5h，测定内种皮中酚类物质（酚酸、黄酮类）的含量。对照为不添加单宁酶，其他条件相同。

3）酶添加量：称取0.5g内种皮加25mL超纯水，超声浸提30min后，加入0.03、0.05、0.1、0.15g单宁酶，在50℃水浴锅中反应5h，测定内种皮中酚类物质（酚酸、黄酮類）的含量。对照为不添加单宁酶，其他条件相同。

1.2.2 酚类物质含量的测定

参照课题组刘雨霞等［13］的方法，利用液相色谱仪测定核桃内种皮酚酸类与黄酮类等酚类物质的含量。

1.3 数据处理与分析

采用Excel 2016软件进行数据整理，采用SPSS 23.0软件进行显著性分析；采用Origin 2021软件制图。

2 结果与分析

2.1 酶解时间对核桃内种皮酚酸类物质含量的影响

由图1-A可知，对照组核桃内种皮中绿原酸含量随着酶解时间的增加呈降低趋势，单宁酶处理组呈先升高后降低趋势，在1h时含量达到最高181.31mg/mL，之后逐渐下降。单宁酶处理组内种皮绿原酸含量均显著高于对照组（P<0.05）。由图1-B可看出，单宁酶处理组与对照组鞣花酸含量均呈先降低后升高趋势，在1h处理时鞣花酸含量最低为1194.97mg/mL，之后逐渐升高。不同酶解时间单宁酶处理组内种皮鞣花酸含量均显著低于对照组（P<0.05）。结果表明，单宁酶酶解可以促进绿原酸积累和鞣花酸降解。酶解1h时绿原酸含量与鞣花酸含量分别达到最高与最低值。

2.2 酶解时间对核桃内种皮黄酮类物质含量的影响

由图2-A、图2-C、图2-D可知，对照组没食子酸、EC含量随着酶解时间增加逐渐降低，而处理组没食子酸、EC含量显著升高（P<0.05）。对照组与处理组EGC含量随着酶解时间的增加均呈先升高后降低趋势。不同时间处理下，单宁酶组没食子酸、EGC、EC含量均显著高于对照组（P<0.05），其中5h处理时没食子酸含量增长倍数最大为3.83；3h处理时EGC增幅最大（21.97%），其次为5h处理（21.93%）；5h处理时EC增幅最大（70.95%），其次为4h处理（56.48%）。由图2-B可知，对照组与单宁酶处理组ECG含量随着酶解时间的增加均呈降低趋势，且在5h时达到最大降幅72.38%。在不同时间处理下单宁酶组ECG含量均显著低于对照组（P<0.05）。结果表明，单宁酶处理5h时能有效降低ECG含量，同时提高EGC、EC与没食子酸含量。

2.3 底物浓度对核桃内种皮酚酸类物质含量的影响

由图3可知，对照组与单宁酶处理组核桃内种皮绿原酸、鞣花酸含量随着酶解时间的增加均呈升高趋势。在不同底物浓度处理下，单宁酶处理组绿原酸含量均显著高于对照组（P<0.05），而鞣花酸含量均显著低于对照组（P<0.05）。其中，绿原酸在底物浓度为10mg/mL时达最大增长倍数2.42，鞣花酸在底物浓度为10mg/mL时达到最大降幅32.38%。结果表明，单宁酶处理的底物浓度为10mg/mL时最有利于绿原酸积累与鞣花酸的降解。

2.4 底物浓度对核桃内种皮黄酮类物质含量的影响

由图4可知，对照组与单宁酶处理组核桃内种皮中没食子酸、ECG、EGC、EC含量随着底物浓度的增加均呈升高趋势。其中，ECG含量较对照组显著降低（P<0.05），且底物浓度为20mg/mL处理时ECG降幅最大（77.69%），其次为40mg/mL处理（72.64%）。同时，单宁酶处理组没食子酸、EGC、EC含量较对照组显著升高（P<0.05），且底物浓度为10mg/mL时没食子酸增长倍数最大为4.36，其次为20mg/mL处理（3.52）；10mg/mL处理时EGC增幅最大（23.25%），其次为20mg/mL处理（13.90%）；40mg/mL处理时EC增幅最大（95.91%），其次为20mg/mL处理（95.34%）。结果表明，单宁酶处理的底物浓度为20mg/mL时能有效降低ECG含量，同时提高没食子酸、EGC与EC含量。

2.5 酶添加量对核桃内种皮酚酸类物质含量的影响

由图5可知，单宁酶处理组核桃内种皮绿原酸含量较对照组显著提高，而鞣花酸含量较对照组显著降低（P<0.05）。酶添加量对核桃内种皮绿原酸、鞣花酸含量的影响不显著（P>0.05）。结果表明，单宁酶处理会显著影响核桃内种皮酚酸类物质的含量，而酶添加量的增加对物质含量影响较小，因此选择1.20mg/mL作为酶添加量较为适宜，可节约成本。

2.6 酶添加量对核桃内种皮黄酮类物质含量的影响

由图6可知，单宁酶处理组没食子酸、EGC、EC含量较对照组显著升高，而ECG含量较对照组显著降低（P<0.05）。单宁酶处理组EGC含量随着酶添加量的增加呈先升高后降低趋势，且在酶添加量为4mg/mL时含量达到最高为8545.97mg/mL。同时，没食子酸、EC含量随着酶添加量的增加逐渐 升高，均在酶添加量为6mg/mL时含量达到最高2352.97mg/mL、190.29mg/mL。而酶添加量对核桃内种皮ECG含量的影响不显著（P>0.05）。结果表明，单宁酶处理会显著影响核桃内种皮黄酮类物质的含量，然而酶添加量的增加对物质含量的影响不大，考虑到试验成本问题，1.2mg/mL的酶添加量为适宜选择。

3 讨论与结论

单宁酶作为一种广泛存在于动物、产单宁植物及微生物中的水解酶，多被用于脱除果实、茶饮品等因单宁物质产生的苦涩味或作为澄清剂改善饮料储藏过程中产生的浑浊问题。有研究表明，单宁酶会影响其水解物的酚类物质含量，提高其抗氧化活性［10-12］。为探究单宁酶对核桃内种皮酚类物质含量的影响。本研究通过单因素试验，探究不同酶解时间、底物浓度、酶添加量下单宁酶对核桃内种皮酚酸、黄酮类等酚类物质含量的影响。分析结果发现，在核桃内种皮中添加单宁酶，可有效分解其酯型儿茶素ECG，进而增加非酯型儿茶素EGC、EC含量与没食子酸含量，这与黄玉凤等［10］在绿茶上的研究结果较一致。植物儿茶素分为酯型儿茶素和非酯型儿茶素，酯型儿茶素具有较强的苦涩味，是引起苦涩味的主要因素，非酯型儿茶素涩味不重，收敛性弱［14］。本试验中，分解酯型儿茶素、增加非酯型儿茶素与没食子酸的最优工艺为：酶解时间5h、底物浓度20mg/mL、酶添加量1.2mg/mL。本研究还发现经单宁酶处理后，核桃内种皮中的绿原酸含量显著升高，鞣花酸含量顯著降低。提取绿原酸并降解鞣花酸的最佳工艺为：酶解时间1h、底物浓度10mg/mL、酶添加量1.2mg/mL。刘雨霞等［13］人研究表明，鞣花酸是引起核桃内种皮苦涩味的主要物质之一。上述研究结果表明单宁酶处理可有效降低核桃内种皮涩味关键物质酯型儿茶素和鞣花酸的含量，当单宁酶降涩的生理机制需后续进一步研究。此外，绿原酸有“植物黄金”之美誉，具有天然的抗氧化、抗炎、抑菌、抗病毒及抗癌等多种生理功能［15-16］。大量细胞和动物试验研究表明，绿原酸能有效抑制肠道炎症，具有促进动物生长、增强机体免疫功能的作用［17-18］。本研究发现单宁酶酶解核桃内种皮可有效提高绿原酸含量，这为进一步利用核桃内种皮生产绿原酸奠定基础。

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收稿日期：2024-01-20

基金项目：山西省科技重大专项计划（202201140601027）;晋中市科技重点研发计划（Y212013）;山西省普通高等学校大学生创新创业训练项目（20220167）

第一作者简介：胡文朝（2002-），男，大学本科，主要从事果实品质形成与调控研究。

*通信作者：张小军（1982-），男，博士，副教授，主要从事果实品质形成与调控研究。E-mail：zhangxj0906@126.com