核桃青皮提取物对梨黑斑病的防治研究

侯敬仪　赵丹　马光　高小宽

摘 要：【目的】采用不同提取剂提取成熟期的核桃果实青皮，研究核桃青皮提取物对梨黑斑病病原菌的抑菌效果，为废弃核桃青皮资源再利用的抑菌构建提供理论支撑。【方法】以梨黑斑病为试验材料，分别用不同浓度（25％、50％、75％、100％）的石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇为提取液提取成熟期的核桃果实青皮，获得核桃青皮提取物，研究核桃青皮提取物对梨黑斑病菌菌丝生长的影响。【结果】甲醇对核桃青皮中对梨黑斑病的抑菌物质的萃取效果最好；核桃青皮中对梨黑斑病的抑菌物质既有水溶性的也有易于有机溶剂萃取的，且在水和有机溶剂量相等时萃取效果最好；1.0 mL的核桃青皮提取物比其他用量对梨黑斑病的抑菌效果更好；50%甲醇提取的成熟期核桃青皮提取物对梨黑斑病菌丝的抑制效果最好。【结论】50%的甲醇提取的成熟期核桃青皮提取物对梨黑斑病菌落生长抑菌效果最好，抑制率可达到38.73%，对病原菌的毒力最强，EC50为4.624 483 442 mL/100mL。

关键词：梨黑斑病；核桃青皮提取物；抑菌

文章编号：2096-8108（2024）03-0056-04中图分类号：S664.1中图分类号文献标识码：A文献标志码

Study on the Prevention and Control of Walnut Green Husk Extract on Pear Black Spot

HOU  Jingyi，ZHAO  Dan，MA  Guang，GAO Xiaokuan*

（College of Life Sciences， Hengshui University， Hengshui Hebei 053000， China）

Abstract： 【Objective】Different extractants were used to extract the green peel of mature walnut fruit， and the antibacterial effect of walnut green peel extract on the pathogen of pear black spot was studied so as to provide theoretical support for the antibacterial construction of the reuse of waste walnut green peel resources.【Methods】With pear black spot as test material， walnut green husk extracts were obtained by using different concentrations （25%， 50%， 75%， 100%）of petroleum ether， ethyl acetate， methanol and ethanol as extracts to extract mature walnut green husk. The effects of walnut green husk extracts on mycelial growth of pear black spot were studied.【Results】Methanol had the best extraction effect on the antibacterial substances against pear black spot in walnut green husk. The antibacterial substances against pear black spot in walnut green husk are both water-soluble and easy to be extracted by organic solvent， and the extraction effect is the best when the amount of water and organic solvent is equal. The antibacterial effect of 1.0 mL walnut green husk extract on pear black spot was better than that of other doses. The mature walnut green husk extract extracted by 50% methanol had the best inhibitory effect on the mycelium of pear black spot.【Conclusion】50% methanol extract of mature walnut peel extract has the best bacteriostatic effect on the colony growth of pear black spot， and the inhibition rate can reach 38.73%. It has the strongest virulence to the pathogen， and the EC50 was 4.624 483 442 mL/100 mL.

Keywords：pear black spot; walnut green husk extract; antibacterial

核桃（Juglans regia L.）別名胡桃、羌桃等，是胡桃科核桃属多年生落叶乔木。核桃青皮作为核桃生产中的副产物，一直被视为废料而弃之，不仅造成了环境污染，同时也浪费了自然资源。随着核桃青皮的利用价值逐渐被发现，国内外学者对其进行了深入研究和探索，并取得了一定的成果。前人的研究中包含了核桃青皮中活性物质的有效成分［1-3］、提取方法及其抑菌作用［4-6］等内容，为核桃青皮的农业开发利用提供一定的参考。梨黑斑病又名裂果病，是梨的三大病害之一，由链格孢属真菌（Alternaria） alternate （Fr．）Keissl 侵染引起。梨黑斑病主要危害梨树叶、果实和新梢，导致树体衰弱，结果年限缩短，并引起贮藏期果实发病，造成重大经济损失［7］。鉴于此，本试验拟在核桃果实成熟期筛选青皮提取物对梨黑斑病病原菌的抑菌效果，构建核桃青皮最佳抑菌效果期，通过抑菌活性测定，找到有效拮抗菌的生长期果实的防效测定，为废弃核桃青皮资源再利用的抑菌构建提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

供试植物病原菌为梨黑斑病储藏期病，经储藏15 d后取病组织分离得到各植物病菌。

从河北昌黎选取10～20株野生核桃树，2023年8月25日分别从每株树上选取无病害的核桃果实10个。

1.2 核桃青皮提取物、病原菌和PDA培养基的制备

1.2.1 核桃青皮提取物的制备

将采的核桃果实剥下青皮烘干、粉粹、过100目筛，混匀后干燥保存。分别称取10g青皮粉末份，分别以乙酸乙酯、甲醇、乙醇、石油醚（25％、50％、75％、100％）为提取液，其中石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇与青皮料液比按照1∶10混匀，25 ℃摇床浸提8 h，四层纱布过滤，取上清液，浓缩至20 mL作为母液，3次重复；将各提取物4 ℃保存备用。

1.2.2 病原菌的分离、纯化和鉴定

参照方中达方法［8］。用70%酒精擦拭病果表面，无菌水冲洗干净后，切取一小块染病组织，在超净工作台中移到PDA培养基上，于25 ℃保温培养，待长出分生孢子后进行单孢分离，纯化后在PDA培养基上保存待用。各菌株在PDA培养基上活化培养至菌落直径接近2/3培养皿直径时，用打孔器在菌落边缘打取直径 5 mm的菌饼。

1.2.3 PDA培养基制备

参照方中达方法进行［8］。首先用天平称量去皮的马铃薯200 g，将其切成小方形块，放入锅中，加无菌水1 000 mL，煮沸30 min。用纱布滤去马铃薯残渣，将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂15～20 g，加热熔化加入葡萄糖20 g。待葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至1 000 mL。分装后，在0.103 Mpa、121 ℃下，高压蒸气灭菌20 min。

1.2.4 对菌丝生长的抑制活性测定

在无菌条件下，从母液分别量取0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0ml核桃青皮提取物加入100 mL的PDA培养基中，摇匀后趁热倒入直径90 mm的培养皿内。预先培养梨黑斑病病原菌，灭菌后用直径为6 mm打孔器在菌落边沿处钻取适量菌龄相同的菌饼，接种于含有杀菌剂的PDA培养基的中央，菌丝面向下，每皿接种1个菌饼，同等浓度做3次重复试验。25 ℃光照培养箱培养6 d，用十字交叉法测量供试真菌菌落生长直径。计算菌丝生长的抑制率。

菌丝生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

1.2.5 数据处理

采用SPSS 11软件处理试验数据。

2 结果与分析

2.1 不同条件下核桃皮提取物对梨黑斑病菌丝的抑菌率的三因素方差分析

采用SPSS对不同溶剂、提取液浓度、用量对抑菌率进行三因素方差分析（见表1）。因变量为抑菌率，3个固定因子分别为溶剂、提取液浓度、用量。方差分析结果表明，溶剂、提取液浓度、用量3个主效应的P值均为0.000，表明不同溶剂、提取液浓度、用量下的抑菌率差异极显著。3个两两交互，溶剂×提取液浓度、溶剂×用量、提取液浓度×用量，以及三者间的交互溶剂× 提取液浓度× 用量的P值也均为0.000，表明以上交互也对抑菌率具有极显著的影响。在选取最佳提取条件时，要考虑三者间的交互作用。

2.2 不同萃取剂提取的核桃青皮提取物对梨黑斑病菌丝的抑制作用

对用石油醚、乙酸乙酯、乙醇、甲醇4种不同溶剂处理核桃青皮，处理后的提取物对梨黑斑病抑菌率进行Duncan法多重比较（α=0.05），结果见图1。4种溶剂处理间抑菌率均差异显著。其中甲醇提取的抑菌率最高达到44.30%；其次是乙醇为39.49%；再次为乙酸乙酯为33.80%，最差的则是石油醚抑菌率为9.07%。这表明，甲醇对核桃青皮中对梨黑斑病的抑菌物质的萃取效果最好。

2.3 不同浓度提取剂提取的核桃青皮提取物对梨黑斑病菌丝的抑制作用

对以上4种有机溶剂的不同浓度，25%、50%、75%、100% 4种不同浓度处理核桃青皮，处理后的提取物对梨黑斑病抑菌率进行Duncan法多重比较（α=0.05），结果见图2。4种浓度间抑菌率均差异显著。其中50%的抑菌率最高达到38.73%；其次是25%为32.95%；再次是100%为28.57%，最差的则是75%抑菌率为36.42%。这表明，核桃青皮中对梨黑斑病的抑菌物质既有水溶性的也有易于有机溶剂萃取的，且在水和有机溶剂量相等时萃取效果最好。

2.4 不同用量核桃青皮提取物对梨黑斑病菌丝的抑制作用

采用5个不同量的萃取物（0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 mL）进行抑菌試验，处理后对梨黑斑病抑菌率进行Duncan法多重比较（α=0.05），结果见图3。5种用量间抑菌率均差异显著。其中1.0 mL的抑菌率最高，抑菌率达到39.41%；其次是0.25 mL为34.41%；再次是0.5 mL为32.10%；第四为0.125 mL，抑菌率为27.57%；最差的则是0.0625 mL抑菌率为24.83%。这表明，1.0 mL的用量相对于其他用量可以取得更好的抑菌效果。

2.5 不同提取液提取的核桃青皮提取物对梨黑斑病菌丝的室内毒力测定

由表2可知，不同提取液提取的核桃青皮提取物对梨黑斑病菌的毒力回归方程的相关系数均高于0.9000，说明该试验具有较高的精密度。由各时期的EC50值可知，50%甲醇提取的成熟期核桃青皮提取物对梨黑斑病菌丝的抑制效果最好，毒力最强，EC50值为4.624483442，相关系数为0.999755572。

3 结论

根据试验结果可得出结论，4种提取物中，甲醇对核桃青皮中对梨黑斑病的抑菌物质的萃取效果最好；不同用量的核桃青皮提取物对梨黑斑病的菌落生长均具有不同程度的抑制效果，其中1.0 mL的核桃青皮提取物相对于其他用量对梨黑斑病可以取得更好的抑菌效果。50%甲醇提取的成熟期核桃青皮提取物对菌落生长抑菌效果最好，此抑制率可达到38.73%，对病原菌的毒力最强，EC50为4.624483442 mL/100mL。

参考文献

［1］杨晓平，胡红菊，王友平，等.梨黑斑病病原菌的生物学特性及其致病性观察［J］.华中农业大学学报，2009，28（6）：680-684.

［2］周靖，尹泳彪，那艳秋.山核桃青果中矿物元素的测定［J］.牡丹江师范学院学报，2001（4）：19-20.

［3］黄支权，任建军，成军，等.核桃青皮抑真菌物质的分离鉴定与抑菌活性［J］.北京农学院学报，2016，31（1）：23-27.

［4］张建斌，柳军玺，查飞，等.青龙衣的化学成分研究［J］.中草药，2009，40（6）：847-849.

［5］吴朝霞，金楠，张敏，等.胡桃醌抑制细菌生长作用的研究［J］.食品工业科技，2012，33（6）：131-134.

［6］刘菲，蔡小宁，杨平，等.32种植物提取物对常见植物病原真菌的抑制作用［J］.安徽农业科学，2009，37（12）：55-58.

［7］王磊.核桃青皮次生物质的抑菌活性研究［D］.杨凌：西北农林科技大学，2010.

［8］方中达.植病研究方法（第三版）［M］北京：中国农业出版社，1998.

收稿日期：2024-03-10

基金项目：衡水学院校级项目（2023ZRY15）；2023年“河北省湿地保护与绿色发展协同创新中心”专项课题（2023XTCX004）；2023年“河北省湿地保护与绿色发展协同创新中心”专项课题（2023XTCX005）

第一作者简介：侯敬仪（2002-），女，在读学生，主要从事植物病理方面的研究。

*通信作者：高小宽（1981-），女，讲师，主要从事植物病理方面的研究。