基于蛋白沉淀光谱分析的核桃涩味评价技术研究

彭佳佳　姚佩　史单华　杨晋豫　郑雄　张小军　刘群龙

摘 要：【目的】建立核桃内种皮涩味综合评价体系，为鲜食核桃品种选育提供理论依据。【方法】选用涩味差异明显的6个核桃品种（系），通过感官评价、内种皮水浸法和蛋白质化学沉淀法相结合的评价方式，初步建立核桃内种皮涩味综合评价技术体系。【结果】6个品种（系）的直接口感涩味值为5.83～9.27，分为差异显著的3类。水浸出物浓度为10 mg/mL时，依据水浸出物涩味值‘汾核4号和‘ND-2为一类，其余4个品种（系）各为一类。内种皮提取液浓度为20 μl/mL时，蛋白沉淀在222 nm波长下吸光值差异最大，可将6个品种（系）分为差异显著的4类。内种皮化学沉淀吸光值与直接口感涩味值的相关系数为0.96，内种皮化学沉淀吸光值与10 mg/mL内种皮水浸出物涩味值相关系数为0.97，均呈极显著正相关。【结论】核桃内种皮提取液浓度为20 μl/mL，222 nm波长条件下，通过蛋白质沉淀全光谱扫描，结合感官评价，可对核桃内種皮涩味进行有效评价。

关键词：核桃；涩味；感官评价；蛋白质沉淀法

文章编号：2096-8108（2024）03-0018-06中图分类号：S664.1中图分类号文献标识码：A文献标志码

Evaluation Technique of Astringency of Walnut Based on Protein Precipitation Spectrum Analysis

PENG  Jiajia，YAO  Pei，SHI  Danhua，YANG  Jinyu，ZHENG  Xiong，ZHANG  Xiaojun，LIU  Qunlong*

（College of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taigu Shanxi 030801， China）

Abstract：【Objective】The establishment of a comprehensive evaluation system for the astringency of walnut kernel pellicle is of great significance to the breeding of fresh walnut varieties.【Methods】In this study， a comprehensive evaluation system for astringency of walnut kernel pellicle was established through sensory evaluation， kernel pellicle water immersion and protein chemical precipitation.【Results】The astringency value of the direct taste of the 6 cultivars was 5.83-9.27， which was divided into 3 categories with significant differences. When the concentration of water extract was 10 mg/mL， according to the astringency value of water extract， ‘Fenhe 4 and ‘ND-2 were classified as one class， and the other 4 cultivars were classified as one class each. When the concentration of walnut kernel pellicle extract was 20 μl/mL， the absorption value of protein precipitation at 222 nm was the most different. The 6cultivars could be divided into 4 categories with significant differences. The correlation coefficients between the light absorption value of chemical precipitation and the astringency value of direct taste and 10 mg/mL water extract of walnut kernel pellicle extract were 0.96 and 0.97， respectively， showing a very significant positive correlation .【Conclusion】Under the condition of 20μl/mL and 222 nm wavelength， the astringency of walnut kernel pellicle extract can be effectively evaluated by the full spectrum scanning of protein precipitation combined with sensory evaluation.

Keywords：walnut; astringency; sensory evaluation; protein precipitation method

世界卫生组织建议成年人每天摄入375～500 g水果和蔬菜，但一些不利于食用的滋味直接影响食物的食用量［1-3］。适当的涩味可丰富果实的滋味，涩味过高则会引起果实品质下降［4-6］。涩味存在于多种植物中，如水果、蔬菜和茶叶。在果实涩味方面研究最多的树种有柿子［7-10］、葡萄［11-13］、苹果［5］、石榴［6］等，涩味物质主要集中分布于种子、果皮和果柄部位［14-15］。涩味物质如儿茶素、黄酮类化合物及酚酸类化合物，在所有植物源食物中都很常见，但对果实的涩味贡献不同，许多涩味物质仅在特定分类群中合成，并对相应物种的涩味起主要作用。

核桃作为多酚物质的第七大来源，其酚类含量显著高于花生、杏仁、榛子等坚果，对人体健康有重要作用。内种皮在保护种仁的同时，其中的酚类物质也为核桃仁增添了涩味。涩味在内种皮高度集中，影响了人们对于核桃产品的消费，同时也影响核桃滋味的口感评价。蛋白质化学沉淀作为体外定量分析涩味的方法之一，可与口感评价相结合对内种皮涩味进行综合评价。本研究选用涩味差异明显的6个核桃品种（系），通过直接口感法、内种皮水浸法和蛋白质化学沉淀法相结合的评价方式，初步建立核桃内种皮涩味综合评价体系，为核桃无涩或低涩种质资源评价提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为‘汾核2号‘汾核4号‘礼品1号‘ND-2‘ND-1和‘农核1号核桃品（系），均栽植于山西农业大学园艺试验站核桃种质资源圃。每个品种（系）选取6株树龄一致、长势较一致的植株，每2株为1个重复，设3次重复。2021年9月果实成熟时，从每株试验树的东、南、西、北4个方向树冠内外随机采集30个无病虫害果实带回实验室，打开坚果，用镊子将核桃种仁和内种皮剥离，液氮速冻，冷冻干燥24 h后研磨成粉，-20℃干燥保存。

1.2 试验方法

1.2.1 感官评价

感官评价小组由23～27岁的10位本课题组成员组成，在进行核桃内种皮涩味口感评价前需进行涩味强度训练，确保小组成员关于涩味标准近于相似。参考Tu等［16］的训练方法，选择不同浓度的单宁酸作为参比溶液对涩味程度进行培训。单宁酸溶液的涩味分为5等级，标准如表1所示。本研究需对核桃内种皮水浸出液与内种皮进行涩味口感评价，在口感评价过程中，保持各样品在口腔中持续20 s左右后吐出后再进行评分，将涩味的平均值作为该样品的涩味值，两个样品间的涩味评价需间隔20 min。

1.2.2 内种皮水浸出物体系的制备

6个核桃品种（系）分别称取100 mg、250 mg、500 mg、750 mg及1000 mg的内种皮干样，用食品级茶包袋进行包装并置于干净烧杯中，加入100 mL 37℃纯净水，搅动茶包使其沉于烧杯底部并静置10 min，得到不同浓度的内种皮水浸出物体系。在每个评审杯中加入10 mL内种皮水浸出液，用于评审小组的口感评价。

1.2.3 化学沉淀法

样品提取液的制备：准确称取0.1 g核桃内种皮粉末，加入5 mL质量分数为50%甲醇水溶液，超声条件参考郑晓宁等［17］方法，温度为40 ℃超声提取50 min（40 KHz），于低温（-10℃）12 000 r·min-1离心15 min，取出上清液待测。

蛋白化学沉淀反应参考陈多多等［18］的方法，稍作修改。不同品种核桃内种皮提取液0.1 mL稀释配制为不同浓度梯度提取液，取不同浓度梯度的提取液0.1 mL于试管中加入0.5 mL 0.1%牛血清蛋白溶液（牛血清蛋白溶于pH值为5的Nacl溶液），使用蒸馏水定容至2.5 mL，37 ℃水浴30 min，利用UV-2600i紫外分光光度计在波长190～750 nm范围对反应体系进行扫描，每个样品重复3次，取平均值。

1.3 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2016进行数据整理，利用SPSS 20.0软件进行相关性分析、显著性分析。

2 结果与分析

2.1 核桃内种皮直接口感涩味评价

对6个核桃品种（系）内种皮的涩味程度进行直接口感涩味评价，结果见表2。参照单宁酸标准溶液涩味体系等级分布对6个品种（系）进行直接口感评价，依据涩味值可将6个品种（系）分为差异显著的3个涩味等级，‘礼品1号和‘汾核2号涩味值分别为9.27和9.03，为第1类，该类别中涩味值显著高于其余4个品种（系）；‘汾核4号和‘ND-2涩味值处于中间值，分别为7.80和8.33，为第2类；‘ND-1和‘农核1号涩味值较低，分别为5.83和6.02，为第3类，该类别涩味值显著低于其余4个品种（系）。‘礼品1号涩味值最高，‘ND-1涩味值最低，最高的涩味值是最低涩味值的1.59倍。

2.2 核桃内种皮水浸出物涩味评价方法的建立

对6个核桃品种（系）果实内种皮的涩味程度进行水浸出物涩味评价，结果见表3。水浸出物浓度为1.0 mg/mL时，6个品种（系）涩味值分布于标准溶液涩味等级1中，‘礼品1号内种皮涩味值最高，为1.07，其涩味值与‘汾核4号‘ND-1和‘农核1号差异显著，与‘汾核2号和‘ND-2差异不显著。其中‘农核1号涩味值最低为0.17，接近0，涩味低于或等于感觉阈值，不利于味觉对涩味的感知。在该浓度下，不同品种（系）涩味值差异较小。

内种皮水浸提物浓度为2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL时，水浸出物涩味值可对不同核桃品种（系）涩味值进行较好区分。水浸出物浓度为2.5mg/mL时，‘礼品1号‘汾核2号和‘ND-2涩味值显著高于其他3个品种（系），‘ND-1涩味为1.50，显著低于其余5个品种（系），该浓度下内种皮涩味值可将6个品种（系）分为差异显著的3类；水浸出物浓度为5.0 mg/mL时，‘礼品1号与‘汾核2号涩味值差异显著，‘ND-1涩味值显著低于其余5个品种（系），该浓度下内种皮涩味值可将6个品种（系）分为差异显著的3类；水浸出物浓度为7.5 mg/mL时，6个核桃品种（系）内种皮涩味值为3.43～7.10，不同品种（系）间涩味值差异显著，分为差异显著的5类；水浸出物浓度为10.0 mg/mL时，6个核桃品种（系）涩味值为5.40～8.83，可将6个品种（系）分为差异显著的5类。因此，核桃内种皮水浸出物浓度为7.5 mg/mL和10.0 mg/mL时，各品种（系）間涩味值差异较大，有利于味觉对不同品种涩味进行区分。

2.3 核桃內种皮化学沉淀涩味评价方法的建立

对6个核桃品种（系）果实内种皮不同浓度提取液与牛血清蛋白质互作发生的化学沉淀进行190～750 nm全光谱扫描，结果见图1。6个品种（系）各浓度内种皮提取液与牛血清蛋白溶液生成的络合物在200～400 nm光谱下吸收值变化较大，核桃内种皮酚类物质与蛋白质互作形成的络合物在222 nm波长处吸光值最大。因此，222 nm波长可用于核桃内种皮酚类物质与蛋白质沉淀的测定。

由表4可知，测定波长为222 nm时，固定蛋白质溶液的浓度，化学沉淀吸光值随核桃品种内种皮提取液浓度的增大而增大。内种皮提取液浓度为5～15 μl/mL，‘ND-1和‘农核1号中化学沉淀吸光值低于最低有效值0.2，内种皮提取液浓度为35～50 μl/mL时，‘礼品1号和‘汾核2号中化学沉淀吸光值高于最高有效值0.8，内种皮提取液浓度为2、25、30 μl/mL时，6个核桃品种（系）内种皮酚类物质与蛋白质形成的络合物吸光值在0.2～0.8有效值之间。内种皮提取液浓度为20 μl/mL，不同核桃品种间吸光值差异最大，‘汾核2号化学沉淀吸光值最高为0.48，‘ND-1化学沉淀吸光值最低为0.20，依据化学沉淀吸光值可将6个品种（系）分为差异显著的4类；提取液浓度为25、30 μl/mL时，依据化学沉淀吸光值将6个品种（系）分为差异显著的3类。不同核桃品种（系）内种皮提取液浓度为30 μl/mL，其化学沉淀吸光值在有效值范围内最大吸光值为0.36～0.73。因此，化学沉淀法中核桃内种皮提取液最适浓度为20 μl/mL，不同核桃品种化学沉淀吸光值差异最显著。

2.4 核桃内种皮直接口感涩味值、水浸出物涩味值和化学沉淀吸光值的相关性分析

对核桃内种皮直接口感涩味值、水浸出物涩味值和化学沉淀吸光值（提取液浓度为20 μl/mL）进行pearson相关性分析，结果见表5。内种皮化学沉淀吸光值与1.0 mg/mL水浸出物的涩味值相关但不显著，1.0 mg/mL水浸出物涩味值对核桃内种皮综合涩味评价影响最小。内种皮化学沉淀吸光值与2.5 mg/mL水浸出物的涩味值呈显著相关（P<0.05），相关系数为0.90。内种皮化学沉淀吸光值与5.0、7.5、10.0 mg/mL内种皮水浸出物涩味值和直接口感涩味值呈极显著正相关（p<0.01），相关系数分别为0.94、0.95、0.97、0.96，与10.0 mg/mL水浸出物的涩味值相关系数最大，10.0 mg/mL水浸出物涩味值对内种皮对核桃内种皮涩味综合评价影响最大。内种皮化学沉淀吸光值与直接口感涩味值相关性系数为0.96，高于化学沉淀吸光值与5.0 mg/mL及7.5 mg/mL内种皮水浸出物的涩味值的相关系数。因此，核桃内种皮涩味评价可依据直接口感涩味值、10.0 mg/mL内种皮水浸出物的涩味值和化学沉淀吸光值进行综合分析。

3 讨论与结论

本研究采用核桃内种皮酚类物质与牛血清蛋白质互作生成化学沉淀的吸光值作为定量分析内种皮涩味的方法，通过对蛋白质化学沉淀全光谱扫描，初步确定222 nm为核桃内种皮蛋白沉淀法的测定波长。王若辉等［19］通过多酚与蛋白质沉淀对数曲线作为衡量核桃内种皮涩味高低的指标，测定波长为320 nm，而本研究中最大吸收波长为222 nm，这可能是由于反应条件（反应时间和蛋白质缓冲溶液）不同所致。陈多多等［18］在对柿单宁涩味进行蛋白质沉淀评价时，测定化学沉淀波长为680 nm，与本研究中波长不一致，可能是由于核桃内种皮与柿子中引起涩味的主要物质不同有关。

本研究发现内种皮化学沉淀吸光值随内种皮提取液浓度的增加而增大，提取液浓度为20 μL/mL时，6个核桃品种（系）化学沉淀吸光值分为差异较大，可分为4类。茶汤滋味研究中发现涩味与水浸出物浓度相关，高浓度水浸出物是茶汤涩味形成的主要原因［20］。叶青青［21］研究表明，蛋白沉淀随涩味物质EGCG浓度的增加而增加，且牛血清蛋白与EGCG生成的沉淀变化值最大。本研究发现化学沉淀吸光值（提取液浓度20 μL/mL）与5.0、7.5、10.0 mg/mL内种皮水浸出物涩味值和直接口感评价内种皮涩味值呈极显著相关（p<0.01），与10 mg/mL内种皮水浸出物涩味值相关系数最高，为0.97。不同核桃品种（系）内种皮涩味在7.5 mg/mL和10.0 mg/mL内种皮水浸出物中差异程度高于1.0、2.5和5.0 mg/mL，这与前人研究结果较一致。对内种皮涩味不同评价方式进行主成分分析，结果表明10.0 mg/mL水浸出物涩味值和直接口感评价内种皮涩味值对内种皮综合涩味影响较大，为影响内种皮涩味评价的主要因素。由于直接口感评价易导致味觉对于不同品种涩味分辨不准确，不利于各品种间涩味强度的分辨［22］。本研究基于前期研究结果，运用水浸法和蛋白质沉淀光谱分析法，结合感官评价，初步建立核桃内种皮涩味综合评价体系，后续将进一步在不同核桃种质资源中进行有效验证。

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收稿日期：2023-12-05

基金项目：山西省科技重大专项计划（202201140601027）；晋中市科技重点研发计划（Y212013）

第一作者简介：彭佳佳（1995-），女，硕士，主要从事果树种质资源创新与利用研究。

*通信作者：刘群龙（1974-），男，博士，教授，主要从事果树种质资源创新与利用研究。E-mail： lql0288@126.com