血清LRG1表达水平在乳腺癌诊断中的应用

孙平 高可欣 包鸿蓉 孙成 张静 王大治

【摘要】 目的：檢测乳腺癌患者血清和癌组织内富亮氨酸α2糖蛋白1（leucine-richalpha-2glycoprotein1，LRG1）的表达并分析其临床意义。方法：选取2021年6月—2022年3月就诊于牡丹江市肿瘤医院的86例女性乳腺癌患者，86例乳腺小叶增生或纤维瘤患者作为良性病变组，21例健康志愿者作为对照组。比较三组血清LRG1的表达差异，分析其与患者年龄、临床分期及淋巴结转移等临床因素的关系。免疫组化染色检测癌组织和癌旁组织内LRG1表达的平均灰度值。结果：乳腺癌组和良性病变组血清内LRG1的表达均明显高于对照组，乳腺癌组LRG1表达明显高于良性病变组，差异均有统计学意义（P<0.05）。不同年龄组乳腺癌患者血清内LRG1的表达，差异有统计学意义（P<0.05）。Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌患者血清内LRG1的表达低于Ⅲ+IV期，差异有统计学意义（P<0.05）。淋巴结转移组血清内LRG1表达明显高于未发生淋巴结转移组，差异有统计学意义（P<0.05）。乳腺癌组织内LRG1平均灰度值明显低于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：LRG1在乳腺癌患者血清和癌组织内明显升高，并与临床因素紧密相关，可作为乳腺癌诊断的潜在生物标志物。

【关键词】 富亮氨酸α2糖蛋白1 乳腺癌 临床分期 淋巴结转移

Application of Serum LRG1 Expression Level in Diagnosis of Breast Cancer/SUN Ping， GAO Kexin， BAO Hongrong， SUN Cheng， ZHANG Jing， WANG Dazhi. //Medical Innovation of China， 2024， 21（12）： 0-043

[Abstract] Objective： To detect leucine-richalpha-2-glycoprotein 1 （LRG1） of breast cancer patients in serum and in cancer tissues， respectively， and to analyze their clinical significance. Method： A total of 86 female patients with breast cancer treated in Mudanjiang Tumor Hospital from June 2021 to March 2022 were selected， 86 patients with lobular hyperplasia or fibroma of the breast were selected as the benign group， and 21 healthy volunteers were selected as the control group. Difference of serum LRG1 expression among the three groups were compared， and then their relationship with clinical factors such as patients' age， clinical stage and lymph node metastasis were analyzed. Mean gray value of LRG1 expression was detected by immunohistochemical staining in breast cancer tissues and the adjacent tissues， respectively. Result： Level of serum LRG1 in breast cancer group and benign group was much higher than that in control group， and LRG1 expression in breast cancer group was significantly higher than that in benign group， the differences were significant difference （P<0.05）. There was significant difference in serum LRG1 expression in patients with different age （P<0.05）. Serum LRG1 expression in patients with stage Ⅰ+Ⅱ was significantly lower than that of patients with stage Ⅲ+Ⅳ， the difference was statistically significant （P<0.05）. Serum LRG1 expression in lymph node metastasis group statistically was higher than that of no lymph node metastasis group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Mean gray value in breast cancer tissues was significantly lower than that in the adjacent tissues， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Serum LRG1 is significantly elevated in serum and cancer tissues of breast cancer patients， and closely related to clinical factors， which can be used as a potential biomarker for diagnosis of breast cancer.

[Key words] Leucine-richalpha-2-glycoprotein 1 Breast cancer Clinical stages Lymph node metastasis

First-author's address： Department of Anatomy， Basic Medicine School of Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.12.010

乳腺癌是全球女性罹患的各種癌症中发病率最高，导致女性死亡的第二大癌症[1-2]。据美国癌症协会（American cancer society，ACS）最新数据统计显示，2022年美国新发乳腺癌病例34万，有4万女性死于乳腺癌，其中浸润性乳腺癌占80%以上[3]。在我国，乳腺癌每年新发病例也呈逐年上升趋势，据国家癌症中心报告，2020年中国新发乳腺癌患者33万，预计2025年将持续增加到36万。乳腺癌不同于肝癌、肺癌等其他癌症，乳腺位于体表脏器较浅位置，形成肿块易被患者早期察觉。早发现、早诊断、早治疗可将早期乳腺癌患者的生存率提高到90%以上[4]。目前临床乳腺癌的确诊主要依靠穿刺活检或肿瘤切除后病理检查，费用高、创伤大，患者不易接受。此外，临床确诊的乳腺癌患者中，仍有接近30%的乳腺癌患者死于远处器官脑、肺、骨的多发转移[5-6]。因此，寻找新的乳腺癌肿瘤标志物，探索乳腺癌侵袭转移机制，既有助于乳腺癌的早期筛查，也利于制订新的治疗方案预防乳腺癌发生转移。

富亮氨酸α2糖蛋白1（LRG1）是富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat，LRR）家族的创始成员，早期作为炎症反应产物从人类血清中发现，被认为是中性粒细胞早期分化标志物，与多种炎症性疾病活动度密切相关[7-8]。作为急性期反应蛋白，当机体受到微生物感染或炎症因子刺激时，血清中LRG1水平急剧增加，在获得性免疫激活之前负责原始免疫反应，与疾病的严重程度直接相关[9-11]。目前，临床乳腺癌常用癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）作为早期筛查的标志物，但由于特异性较差，还需寻找新的分子标志物。有关LRG1作为乳腺癌早期诊断标志物的相关研究报道较少，有待进一步研究。本研究采用ELISA分别检测乳腺癌、乳腺良性病变和健康人群血液内LRG1蛋白的表达，并分析其与患者年龄、临床分期和淋巴转移等临床因素的相关性；同时采用免疫组化染色法检测乳腺癌组织和癌旁组织内LRG1的表达，分析LRG1在乳腺癌组织内的表达，并探讨血清LRG1表达在乳腺癌患者诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年6月—2022年3月就诊于牡丹江市肿瘤医院的86例女性乳腺癌患者。纳入标准：（1）符合乳腺癌的临床诊断指标；（2）就诊时未接受放疗、化疗、内分泌的治疗；（3）乳腺癌初诊；（4）临床资料完整。排除标准：（1）合并其他肿瘤疾病；（2）乳腺癌复发或乳腺癌术后；（3）合并有心、肝、肾、脑系统疾病；（4）妊娠期或哺乳期；（5）临床资料不全。患者术后切除癌组织和癌旁组织放入10%多聚甲醛溶液中固定，用于免疫组化染色。术前采集肿瘤患者外周血。86例乳腺小叶增生或纤维瘤患者作为良性病变组。纳入标准：（1）均经B超或X线确诊的乳腺小叶增生或纤维瘤；（2）年龄>18岁；（3）未接受药物治疗；（4）临床资料完整。排除标准：（1）肝、肾功能异常；（2）对研究依从性不佳；（3）合并其他乳腺疾病。21例健康志愿者作为对照组。纳入标准：（1）经

B超或X线确诊乳腺形态、结构正常；（2）年龄>18岁；（3）临床资料完整。排除标准：（1）肝、肾功能异常；（2）对研究依从性不佳；（3）长期应用激素药物。患者和家属均签署知情同意书。本研究经牡丹江市肿瘤医院医学伦理委员会批准后实施。

1.2 方法

（1）所有受试对象均于清晨空腹采血5 mL，

2 000 r/min离心10 min后，静置30 min后收集上层血清，-70 ℃冰箱保存备用。采用ELISA法检测各组血清内LRG1的表达。ELISA试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司，于450 nm处检测各组样品的吸光度（OD）值，操作步骤按说明书规范进行。（2）所有肿瘤患者组织标本采用免疫组化染色，经固定、包埋后制成3 μm厚的石蜡组织连续切片，覆于防脱载玻片上；经脱蜡、脱水，枸橼酸高压缓冲液修复10 min后室温冷却，PBS冲洗3次；3%H2O2抗原修复10 min，PBS冲洗3次；滴加一抗为小鼠抗人LRG1单克隆抗体（1︰100） 于4 ℃过夜，PBS冲洗3次；滴加二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，孵育30 min，PBS冲洗3次；DAB染色，苏木素复染，中性树脂封片，显微镜下观察。

1.3 观察指标与评价标准

采用ELISA法检测乳腺癌组、乳腺良性病变组及对照组患者血清内LRG1的表达，比较各组LRG1表达的差异。采用免疫组化DAB染色，检测86例乳腺癌患者组织切片内LRG1的表达，细胞质内出现棕黄色染色为阳性。利用Image J图像软件测量细胞内LRG1表达的平均灰度值，平均灰度值=背景灰度值-实测灰度值，染色越深，平均灰度值越小。

1.4 统计学处理

采用统计软件SPSS 22.0进行数据分析，计量资料采用（x±s），比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组基线资料比较

乳腺癌组年龄32～75岁，平均（44.32±6.16）岁；良性病变组年龄28～69岁，平均（43.18±5.21）岁；对照组年龄为33～73岁，平均（43.27±5.09）岁。三组年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 各组血清内LRG1的表达

ELISA检测结果显示，对照组血清LRG1为（38.03±1.22）ng/mL，乳腺癌组和良性病变组血清LRG1分别为（129.58±3.45）ng/mL和（73.93±7.52）ng/mL。與对照组相比，乳腺癌组和良性病变组血清LRG1的表达水平均明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。乳腺癌组和良性病变组相比，血清LRG1的表达水平也明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 乳腺癌患者血清内LRG1表达的临床意义

不同年龄组乳腺癌患者血清内LRG1的表达相比，差异有统计学意义（P<0.05）。其中Ⅰ+Ⅱ期48例，Ⅲ+Ⅳ期38例；伴有淋巴结转移者39例。Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌患者血清内LRG1的表达低于Ⅲ+Ⅳ期患者，差异有统计学意义（P<0.05）。发生淋巴结转移的乳腺癌患者血清内LRG1的表达高于未发生淋巴结转移的患者，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.4 乳腺癌组织和癌旁组织内LRG1的表达

免疫组化染色结果显示，LRG1在乳腺癌细胞质内呈阳性表达，而癌旁组织内LRG1的表达不明显。乳腺癌组细胞质内LRG1的平均灰度值为（31.02±6.81），明显低于癌旁组的（89.54±9.83），差异有统计学意义（t=-45.381，P<0.05）。见图1。

3 讨论

乳腺癌早期筛查和正确诊断对指导患者制订治疗方案，提高患者的生存率，改善患者预后具有重要意义。近年来，血清肿瘤标志物检测在乳腺癌的诊断和分期中发挥越来越重要的作用。血清肿瘤标志物由肿瘤细胞产生并分泌到血液循环中，以糖类、激素、蛋白质等代谢产物形式存在的一类物质，可在某种程度上反映肿瘤的生长情况。由于其具有快速、无创、费用低廉等特点，常用于肿瘤的早期筛查和治疗方案的评估[12]。CEA作为一种广谱的肿瘤标志物，常用于乳腺癌的辅助诊断和监测患者的病情发展[13]。但CEA作为一种起源于消化系统癌症的多糖复合物，在乳腺癌的诊断中还存在敏感度不够，特异度差等缺点，因此，需要寻求新的肿瘤标志物提高对乳腺癌发生发展的预测能力。

LRG1属于一种血清分泌蛋白，包裹于胞浆的囊泡中，由肿瘤细胞分泌到细胞外发挥生物学功能。已有研究证实，LRG1可作为血清肿瘤标志物应用于肿瘤的早期筛查中[14-15]。如国内学者陈周峰等[16]检测直肠癌患者血清中LRG1的表达水平明显高于良性肿瘤组和健康对照组，并随肿瘤分期增加，LRG1的表达水平明显升高。国外Yammoto等[17]检测了184例胃癌患者血清内LRG1的表达，发现LRG1高表达组的总生存率明显低于LRG1低表达组，总体生存率的Cox多变量分析显示LRG1表达是一个独立的预后因素。本研究结果显示，乳腺癌组LRG1的表达水平明显高于良性病变组和对照组，可作为乳腺癌的鉴别诊断参考指标。进一步分析发现，LRG1的表达会随着肿瘤分期增加表达上调，表明LRG1与乳腺癌病程进展、严重程度有关。淋巴结转移是乳腺癌最常见的转移途径，临床患者多因自查发现腋窝淋巴结肿大而就诊，淋巴结是否肿大是鉴别乳腺肿块良、恶性的重要体征之一[18-20]。本研究发现淋巴结转移组LRG1的表达明显高于未发生淋巴结转移组，意味着乳腺癌患者血清内LRG1的升高与癌细胞淋巴转移相关，可作为早期判断癌细胞是否发生淋巴结转移的评估指标。此外，本研究通过免疫组化染色发现，LRG1在乳腺癌组织内呈明显阳性表达，而癌旁组织基本不表达，表明LRG1在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用。可见，作为乳腺癌衍生的血液标志物，LRG1的血清水平可作为乳腺癌诊断的潜在生物标志物，值得今后临床高度重视。

综上所述，本研究表明LRG1的血清水平可作为乳腺癌患者潜在的诊断标志物。当然，肿瘤细胞并不是LRG1的唯一来源，在肿瘤微环境（tumor microenviroment，TME）中，包括内皮细胞和髓细胞在内的基质细胞也有助于LRG1的产生。因此，LRG1联合其他肿瘤分子标志物联合检测，或许更有助于提高乳腺癌早期诊断率，这有待后续研究进一步证实。

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（收稿日期：2023-10-20） （本文编辑：白雅茹）