响应面法优化松针板栗黑米酒的发酵工艺

尤洁,宋飞飞,吴伟斌

(福建生物工程职业技术学院 药学系,福建 福州,350007)

松针是松科松属植物的叶子,因其形如针而得名。松属植物是世界上分布广泛、资源丰富、四季常绿的树种之一,是可持续利用的再生资源[1]。松针是松属植物主要的副产物之一,也是其主要药用部位[2];板栗是一种富含糖、氨基酸、蛋白质、脂肪的营养及经济价值高的植物果实,是人体必需脂肪酸、矿物质、维生素和膳食纤维的良好来源[3-4]。黑米酒,是一种以黑米为原料制作的酒[5],是纯天然饮料,不加香精、糖和色素却香甜醇厚,色泽鲜亮,绿色、原生态等特点使其在众多发酵酒中脱颖而出,独树一帜[6-7]。

松针提取物含有丰富的水溶性黄酮、多种矿物质和维生素[8],具有抗炎、抗癌、降压、抗氧化、清除自由基等作用[9-11],但现阶段松针的应用仍处于原始状态,其药用价值和保健价值尚未得到开发[12]。板栗是一种药食同源的农产品[13],糖分是其基本营养成分,因口感独特、营养丰富而备受好评。但是,新鲜板栗贮藏条件苛刻,产量受季节限制,市场上鲜板栗深加工较少[14]。

将松针和板栗作为辅助性原料引入黑米酒的发酵工艺中,不但能提高它们的利用率和深加工开发力度,还可以改善传统黑米酒的功能性,大幅提升其多糖含量和风味[15-16]。因此对松针板栗黑米酒的发酵工艺进行优化具有十分重要的意义。本文采用响应面法对松针板栗黑米酒的发酵工艺进行了优化,旨在为松针板栗黑米酒及其他新型风味发酵酒的价值提升及应用开发提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马尾松松针,采自福州鼓山;板栗、黑米均为市售;NaCl、无水乙醇、葡萄糖等试剂均为分析纯,西安天茂化工有限公司;甜酒曲、米酒曲和小曲,绍兴古越龙山酿酒有限公司;果酒酵母、葡萄酒酵母、米酒酵母(食品级),湖北安琪酵母股份有限公司;果胶酶(7 500 PGNU/g)、明胶、硅藻土、壳聚糖,成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

GZX-9140MBE电热恒温鼓风干燥箱、HPX-9272MBE电热恒温培养箱,上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;800y多功能粉碎机,武义海纳电器有限公司;FA2004电子天平,上海舜宇恒平科技仪器有限公司;SHB-B95A真空泵,郑州长城科工贸有限公司;WD-9415C超声清洗器,北京六一生物科技有限公司;YM50Z智控型立式压力蒸汽灭菌器,上海三申医疗器械有限公司;不锈钢正压桶式过滤器,上海信步过滤设备制造有限公司;HL-10D蒸饭柜,浙江宁波赵记电器有限公司;HH-8数显恒温水浴锅,上海力辰邦西仪器科技有限公司;PHSJ-3F pH指示计,上海仪电科学仪器股份有限公司;酒精计,河北省武强县同辉仪表厂;砂罐(5 L)装、陶瓷瓶(0.5 L)装,福建德化县朴达陶瓷有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

松针板栗黑米酒酿造工艺流程如下,可分为前处理、主过程、后处理3个阶段(图1)。

图1 松针板栗黑米酒酿造工艺流程Fig.1 Brewing process of pine needle chestnut black rice wine

原料前处理→蒸煮→淋饭冷却→拌曲糖化→搭窝培菌→冲缸→主发酵→过滤→灭菌→装瓶→陈酿→成品

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 前处理

选用新鲜嫩绿的松针;由于在试验中使用的板栗和黑米均为市售,为保证试验的可复制性和推广性以及结果的精准性和可靠性,对选取的板栗和黑米进行了一定的质量分析及相关指标的测定。选取的板栗表面光滑且无裂痕,形状端正,大小均匀,淀粉含量68%(质量分数,下同)、含水率55%、油脂含量1.5%、蛋白质含量5%、糖含量7%、灰分含量1%;黑米颗粒饱满,无杂质,颜色均匀,淀粉含量77%、含水率12%、膨化度1.3、脂肪酸含量2.5%、蛋白质含量9%。

称取20 g新鲜松针,清洗干净,切成5 cm长,用50 g/L NaCl溶液浸泡12 h,水位没过松针2 cm。将松针段在50 ℃恒温干燥3 h至恒重后,将其粉碎到80目。用体积分数为60%的乙醇充分浸泡45 min。然后用内沸法加入80 ℃热水中恒温加热30 min,料液比1∶20(g∶mL)。将松针粉过滤得到松针提取物;栗子去皮洗净,栗仁切碎,无大颗粒即得栗粉。将黑米洗净,室温20 ℃,浸泡12 h后,取出沥干;将由甜酒曲、米酒曲和小曲组成的复合曲(质量比5∶3∶2)在23 ℃的适量水中浸泡3 h活化。

采用松针提取物进行发酵,而不是直接将松针放入发酵,这样可以防止发酵过程中因松针导致酒体变成青灰色,而内沸法可以有效提高松针中黄酮多酚类和多糖物质的溶出度,不仅不会减少松针中的活性成分,还能减轻酒中的苦涩感[17]。

1.3.2.2 蒸煮淋饭

称取预处理过的黑米650 g和板栗末350 g拌匀,组成初始原料,把原料放在蒸饭箱内,在100 ℃下蒸45 min。将蒸熟的板栗和黑米取出,放在消毒过的纱布上,用冷开水冲至30 ℃左右。此操作步骤不仅可以降低板栗和黑米的温度,增加水分,还可以使黑米表面光滑,使颗粒分离,透气,有利于下一步混合酒曲和“搭窝”。这一过程要尽可能的快速进行,尽量避免将蒸好的板栗和黑米暴露在空气中时间过长,造成细菌污染。

1.3.2.3 拌曲糖化

针对黑米糖化困难的实际情况,采用甜酒曲、米酒曲和小曲质量比5∶3∶2的组合,复合发酵[18]。将加工过的板栗、黑米和活性酒曲按照酒曲的添加量占原料质量的0.8%进行搅拌。将搅拌均匀的混合物放入砂罐中,将其表面做成一个倒喇叭状的窝,用酒精擦拭砂罐内壁和罐盖,并用无菌纱布覆盖,严实密封,避免杂菌的污染。将其置于23 ℃的恒温培养箱内进行糖化发酵,发酵后可出现菌丝体和糖液。糖化酶的活性在50 h左右达到最高,然后霉菌进入衰退阶段,糖化酶的活性也随之降低。因此,糖化反应的时间为48 h,之后进行发酵和成熟。

1.3.2.4 主发酵

考虑到酵母的生态喜好性和菌体量的平衡,将果酒酵母、葡萄酒酵母、米酒酵母按质量比1∶0.8∶1混合,加入体积分数2%的葡萄糖水,28 ℃活化50 min[19]作为较为适宜的酵母接种条件,能够最大程度地促进发酵效率,从而得到了较好的黑米酒发酵效果。将活化的混合酵母加入砂罐中,加入30 g松针汁和500 g水,发酵液的初始还原糖质量浓度在100 g/L左右。然后在23 ℃的恒温培养箱中进行主发酵。每8 h进行1次搅拌。测定每日的酒精含量及还原糖的浓度,直至还原糖的浓度稳定,发酵8 d左右,完成主发酵进程。

1.3.2.5 后处理

对砂罐中发酵物进行手动压滤。将滤液置于4 ℃沉淀1 d,取上清液,加入明胶和壳聚糖复合澄清剂澄清,再用0.45 μm不锈钢正压桶式过滤器过滤。在85 ℃下加热25 min后在110 ℃下进行超高温灭菌15 s,然后快速冷却。冷却后装入经高温灭菌的陶瓷瓶中,即得试验用酒。继续在4 ℃和30 ℃温度下交替陈酿,间隔10 d,共陈酿40 d,即得成品松针板栗黑米酒。

1.3.3 发酵工艺优化

单因素试验:松针汁添加量[1%、2%、3%、4%、5%,质量分数(下同)]、板栗添加量(20%、25%、30%、35%、40%)、复合酒曲添加量(0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)、混合酵母添加量(0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%)、发酵温度(24、26、28、30、32 ℃)和发酵时间(4、5、6、7、8 d)为影响因素,进行单因素试验,采用非糖固形物含量、酒精含量、氨基酸态氮含量为主,感官评价为辅的评价指标体系,以此综合考察各因素对松针板栗黑米酒品质的影响[20]。响应面试验:在单因素试验的基础上,4个评价指标通过权重均衡化和离差标准化得出的综合加权分作为响应值(Y),利用DesignExpert12软件设计3因素3水平的响应面试验(表1),确定松针板栗黑米酒的最佳发酵工艺参数。

表1 Box-Behnken设计试验因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design test

1.3.4 测定方法

酒精含量的测定:重铬酸钾氧化法;还原糖浓度测定:GB 5009.7—2016《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》直接滴定法;pH值、氨基酸态氮含量的测定:GB/T 13662—2018《黄酒》电位滴定法;非糖固形物含量的测定:GB/T 13662—2018《黄酒》重量法(仲裁法);水浸法:将经预处理的松针加入水中,于80～90 ℃恒温下进行加热。醇提法:在90 ℃下按料液比1∶20(g∶mL)进行浸提。内沸法:将经预处理的松针在50%(体积分数)的乙醇溶液中按料液比1∶1(g∶mL)充分浸没,过滤后,将松针粉加入80 ℃的温水中恒温加热[21]。

1.3.5 感官评定方法

感官评价小组由10名(5男5女)具有较强食品口感控制能力和相关经验的食品专业人员组成,均已通过食品品质分析及其应用等专业课程,且经过预选、初选、终选和统一培训等环节,以保证感官评价结果的可靠性和可信度。在预选阶段,筛选了具有较好味觉和嗅觉能力的人员;在初选阶段,将相关人员带入实验室进行初步的感官培训和限制性培训;在终选阶段,选定了较为敏锐的人员作为感官评价人员,并对其进行进一步的感官评价统一培训。

感官评价小组分别对松针板栗黑米酒的色、香、味、风格进行打分,总分100分,感官评价标准列于表2。

表2 松针板栗黑米酒感官评定标准Table 2 Sensory evaluation standard of pine needle chestnut black rice wine

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Response surface test design and results

1.3.6 统计分析

使用Design-Expert 12软件,按照Box-Behnken中心组合实验设计原则进行响应面试验,使用SPSS 22.0统计软件对试验结果进行多重比较。使用Origin 2022软件绘制图表的组件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 辅料添加量对发酵工艺的影响

由图2-a可知,当松针汁添加量为2%时,酒的非糖固形物含量达到了最高值25.3 g/L,酒精含量为13.6%,氨基酸态氮含量为0.48 g/L,感官评价为88分。当松针汁添加量超过2%时,醪液的发酵度降低,酒精含量不足,导致酒体不够协调浓郁[22]。由图2-b可知,板栗的最佳添加量为25%,在此添加量下,酒的非糖固形物含量为25.8 g/L,酒精含量为15.2%,氨基酸态氮含量为0.61 g/L,同时感官评价为90分。板栗添加量不足25%时,口感层次不够丰富,感官评价偏低;而超过30%时,蛋白质含量较高,影响酒的浑浊度。因此,在进行综合分析各指标含量和感官评价后,确定板栗与松针汁的最佳添加量分别为25%和2%。

a-松针汁添加量;b-板栗添加量

2.1.2 发酵剂添加量对发酵工艺的影响

由图3-a可知,当复合酒曲添加量较少时,样品的非糖固形物含量、酒精含量和氨基酸态氮含量均较低,感官评价也不高。随着复合酒曲添加量的增加,在1.2%时达到最优,但添加量超过1.2%后,酒精含量显著升高,感官评价则显著降低,并出现较大的酸味。这可能是由于复合酒曲过多,导致发酵不完全或产生气味,进而引发酸败。图3-b显示,在松针板栗黑米酒中,随着混合酵母使用量的增加,氨基酸态氮含量逐渐升高。当混合酵母添加量为0.10%时,非糖固形物含量达到最大值23.5 g/L,而酒精含量在0.04%～0.08%使用量范围内随混合酵母使用量的增加而逐渐升高,当添加量为0.08%时,酒精含量可达14.9%。但超过0.08%的添加量后,酒精含量反而会降低。经过综合分析比较,最佳混合酵母使用量为0.10%。

a-复合酒曲添加量;b-混合酵母添加量

2.1.3 发酵条件对发酵工艺的影响

适宜的发酵温度有利于酵母中微生物的生长代谢,促进发酵和酒精等生成物的产生,使黑米酒的香味更加丰富[23]。由图4-a可知,发酵温度升高时,酒精、非糖固形物和氨基酸态氮含量均先增加后减少,28 ℃时达到最佳值(非糖固形物含量26.1 g/L,酒精含量14.3%,氨基酸态氮含量0.58 g/L,感官评价90分)。发酵温度过高则导致糖分消耗过多,酸含量过高,各指标下降。此外,图4-b显示,随着发酵时间延长,非糖类固形物含量减少,而氨基酸态氮和酒精含量增加。发酵初期,糖分含量较高,而随着时间推移,酵母转化糖分生成乙醇,提高酒精含量。同时,酒曲中的蛋白酶分解蛋白质,形成氨基酸和多肽,增加酒香的刺激性,影响口感。综合分析显示,发酵温度28 ℃和7 d的发酵时间是最佳条件。

a-发酵温度;b-发酵时间

2.2 响应面优化发酵工艺试验结果及分析

2.2.1 数字模型的建立及分析

以单因素试验为基础,对松针板栗黑米酒的发酵工艺进行了研究。以松针汁添加量(A)、板栗添加量(B)、发酵时间(C)作为影响因素,综合加权分(Y)作为反应值,进行3因素3水平的响应面试验。

2.2.2 响应面试验方差分析

对试验结果进行多元回归拟合后,获得各因素水平对松针板栗黑米酒综合加权分(Y)影响的二次多项回归模型:Y=-355.67+22.26A+2.56B+103.92C+0.26AB-0.10AC+0.02BC-6.48A2-0.060B2-7.21C2

表4 响应面试验方差分析Table 4 Variance analysis of response surface test

采用Design-Expert 12软件,通过Origin 2022绘图,得到了松针板栗黑米酒的发酵过程的响应面和等高线,可以较好地反映各种因素以及它们之间的交互作用。响应面曲线越大,说明两个因子之间的相互影响就越明显。由图5可知,松针汁添加量、板栗添加量与发酵时间的相互作用对综合加权分的影响。响应面的开口都向下,且有最高值,图5-a显示,松针汁添加量和板栗添加量交互的等高线为椭圆,表明对结果有较大的影响,且与方差分析相吻合。

a、d-松针汁添加量和板栗添加量交互响应面及等高线图;b、e-松针汁添加量和发酵时间交互响应面及等高线图;c、f-板栗添加量和发酵时间交互响应面及等高线图

2.3 最佳工艺参数确定与验证

通过Design-Expert 12软件分析,得到松针板栗黑米酒的最佳发酵工艺条件为松针汁添加量2.206 12%,板栗添加量27.325 3%,发酵时间7.229 62 d,模型预测的综合加权分最大预测分值为79.492 5。考虑到实际操作性,综合调整发酵工艺参数为松针汁添加量2.2%,板栗添加量27.3%,发酵时间7 d,复合酒曲添加量1.2%,混合酵母接种量0.1%,发酵温度28 ℃,取3次试验数据的平均值,综合加权分为80.13,结果表明,响应面模型与实际状况吻合较好,可以有效地指导发酵过程的优化。

3 结论与讨论

研究发现,采用黑米酒发酵工艺,使用松针和板栗作为主要辅料,通过使用非糖固形物含量、酒精含量、氨基酸态氮含量等指标体系进行综合考察,感官评价作为辅助评价指标,来评价各因素对松针板栗黑米酒品质的影响。结果表明,松针和板栗是促进黑米酒品质的主要因素之一,它们对黑米酒的口感和品质影响显著。在单因素试验基础上,响应面试验得出最佳发酵工艺条件为:松针汁添加量2.2%,板栗添加量27.3%,发酵时间7 d,复合酒曲添加量1.2%,混合酵母接种量0.1%,发酵温度28 ℃,最终酒精含量为15.8%。制得的松针板栗黑米酒呈玫瑰色,色泽亮丽,口感柔软,酒体和谐。

松针含有丰富的挥发性精油和多种有机酸,板栗富含淀粉和单宁酸等营养成分,能够促进松针板栗黑米酒的形成和口感的提升。通过对实验结果及文献的比对和分析发现,使用松针和板栗作为辅料,能够显著提升黑米酒的品质,这是一个具有潜力的酿造方式。未来需要进一步验证实验中的松针和板栗是否具有协同效应,探究板栗和松针对黑米酒酿造的影响机制,以提供更准确的理论支持来改进酒类生产工艺。