3株内生菌对棉花枯萎病菌拮抗效果研究

祖丽胡玛尔·买提喀迪尔 代先兴 李猛 王天舒 闫成才 牛冬冬 郝海婷

摘要  ［目的］ 探究3株棉花内生菌对棉花枯萎病菌的拮抗效果。［方法］ 以棉花枯萎病菌为试材，采用平板对峙法将3株内生菌菌悬液、上清液、菌挥发物分别对峙棉花枯萎病菌研究3株内生菌拮抗效果。［结果］ 3株内生菌菌悬液对棉花枯萎病菌的拮抗效果为O＞T＞DG3-1；3株内生菌上清液对棉花枯萎病菌的拮抗效果为T＞O＞DG3-1；3株内生菌菌挥发物对棉花枯萎病菌拮抗效果为DG3-1＞T＞O。并对抑制过的枯萎病菌菌丝形态进行显微观察，结果显示，菌丝出现空腔、断裂以及细胞壁部分溶解。重新培养抑制过的枯萎病菌，枯萎病菌可以正常生长，但生长较慢。［结论］ 3株内生菌对枯萎病菌生长有不同程度的影响。

关键词  芽孢杆菌;根瘤菌;内生菌;棉花枯萎病;拮抗

中图分类号  S435.621  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）09-0116-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.09.026

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the Antagonistic Effect of Three Strains of Endophytic Bacteria on Cotton-wilt Fusarium

Zulihumaer· Maitikadier， DAI Xian-xing， LI Meng et al

（Key Laboratory for Comprehensive Management of Agricultural Pests in Southern Xinjiang，Tarim University， Alar， Xinjiang 843300）

Abstract  ［Objective］To explore the antagonistic effect of three endophytic bacteria in cotton against Fusarium wilt.［Method］Using the plate confrontation method， three endophytic bacterial suspensions， supernatants， and volatiles were used to study the antagonistic effects of the three endophytic bacteria against the cotton Fusarium wilt pathogen. ［Result］The antagonistic effect of the three bacterial suspensions on Fusarium oxysporum was O>T>DG3-1. The antagonistic effect of the supernatant of the three bacterial strains on F. oxysporum was T>O>DG3-1; the antagonistic effect of volatiles from three strains of bacteria on F. oxysporum was DG3-1>T>O. Microscopic observation of the morphology of the mycelium that suppressed F. oxysporum showed cavities， breakage， and partial dissolution of the cell wall. Recreate the inhibited F. oxysporum， which could grow normally but slowly. ［Conclusion］Three endophytic bacteria have varying degrees of influence on the growth of Fusarium wilt.

Key words  Bacillus;Rhizobium;Endophytic bacteria;Cotton Fusarium wilt;Antagonism

基金项目  南京农业大学-塔里木大学科研联合基金项目（NNLH-202002）；塔里木大学校长基金（TDZKJC201801）；2022校级大学生创新创业训练计划项目（2023014）；2022校级研究生科研创新项目（TDGRI202224）。

作者简介  祖丽胡玛尔·麦提喀迪尔（2000—），女，新疆和田人，硕士研究生，研究方向：植物病理。

*通信作者，副教授，博士，从事植物与微生物互作研究。

收稿日期  2023-07-05；修回日期  2023-11-06

棉花是我国重要的一种经济作物，在推动我国国民经济的发展过程中起着重要且不可取代的作用。新疆棉花总产量和种植面积处于稳步增长状态，已经连续20多年位居全国第一位［1］。随着种植面积的不断扩大和连作种植土传病害发生严重，经常与棉花黄萎病混合侵染，导致病害频繁严重影响棉花的产量和品质［2-3］。

棉花枯萎病是由尖孢镰刀菌萎蔫专化（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum（Atk.）Snyder et Hansen）引起的土传病害［4］。病原菌主要通过土壤进行传播，也可以通过带菌的棉壳、带菌的种子、风雨、病残体、浇水和施肥工具等传播。病菌以菌丝体、分生孢子、厚壁孢子在土壤、棉籽壳、病残体上越冬。由于菌丝和孢子的大量繁殖可以促使薄壁组织大量繁殖胶状物质，引起导管堵塞同时病原菌大量繁殖毒素造成棉叶枯萎脱落甚至整株枯死［5］。棉花枯萎病在棉花整个生長期都可发病，导致棉花枯萎并脱落，影响棉花品质和产量。

生物防治方法是指利用微生物之间的拮抗能力抑制病原物的方法。主要包括真菌、细菌和放线菌，由于具有绿色、成本低和安全的特点，生物防治方法是防治各种植物病害切实可行的策略之一［6］。除生物防治外，农业防治和化学防治也是防治棉花枯萎病的有效措施。农业防治主要是通过拔出病株，搬出病土，采用无病种子，但农业防治效果不显著需数年累计。化学防治成本较低，效果显著但长期使用农药病虫会产生抗药性［7］。通过多个试验案例验证对植物病害有拮抗效果的有益微生物直接或间接的方式达到阻碍或杀死病原菌的效果［8］。利用有益微生物防治棉花枯萎病的实际应用已有报道。柳自清等［9］研究短小芽孢杆菌KX-33种衣剂对棉花枯萎病的盆栽防效。丁建朋等［10］研究生防菌HFW217对棉花枯萎病的防治效果。袁晓娟等［11］验证含短小芽孢杆菌的种衣剂对棉花枯萎病有拮抗效果。笔者以棉花枯萎病菌为靶标菌，采用平板对峙法将3种内生菌（解淀粉芽孢杆菌O、贝莱斯芽孢杆菌T、根瘤菌DG3-1的菌悬液、上清液以及菌液挥发物）分别对峙棉花枯萎病菌，比较3株内生菌对棉花枯萎病菌的拮抗效果，并通过回接培养观察3株内生菌对枯萎病菌生长的影响，验证3株内生菌对棉花枯萎病拮抗效果，为后期制备拮抗棉花枯萎病菌菌剂提供菌种资源。

1  材料与方法

1.1  试验材料

供试病原菌：尖孢镰刀菌由植物保护专业病理实验室但红侠老师提供。

供试内生菌：解淀粉芽孢杆菌（O）、贝莱斯芽孢杆菌（T）、根瘤菌（DG3-1）由笔者所在实验室从棉花上分离所得。试验于2021年3—6月在新疆阿拉尔南疆农业有害生物综合治理重点实验室进行。

1.2  培养基

LB固体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，琼脂粉15 g/L，氯化钠10 g/L，水1 L。

LB液体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，水1 L。

PDA固体培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15 g/L，水1 L。

PDB培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，水1 L。

1.3  试剂和仪器

试剂：酵母提取物、葡萄糖、琼脂粉、胰蛋白胨、甘油、琼脂糖购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

仪器：SPX型智能生化培养箱（宁波江南仪器制造厂）；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台（苏州净化）BXM-75VE立式蒸汽灭菌器；D8023CTL-K4型微波炉（佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司）；D-37520冷冻离心机（赛默飞世科技（中国）有限公司）；2D-AS型恒温培养摇床（常州万顺仪器制造有限公司）。

1.4  试验方法

1.4.1  3株内生菌菌悬液对棉花枯萎病菌拮抗试验。

采用传统平板对峙法［12］，用直径2.5 mm的打孔器打出棉花枯萎病菌菌饼，并将菌饼接种至倒满PDA培养基的培养皿正中心，并在26 ℃的培养箱倒置培养4 d，第4天对3株内生菌摇菌并离心处理，倒掉上清液，往沉淀的内生菌加同等量的灭菌水，摇晃将灭菌水和沉淀混匀制备菌悬液，并将菌悬液同等量接种到病原菌3 mm处的4个边上，重复3次，以接种灭菌水作为对照。

1.4.2  3株内生菌上清液对棉花枯萎病菌拮抗试验。

采用传统平板对峙法［12］，用直径2.5 mm的打孔器打出棉花枯萎病菌菌饼，并将菌饼接种至PDA培养基的培养皿正中心，并在26 ℃的培养箱倒置培养4 d，第4天对3株内生菌摇菌并离心处理，将离心的上清液同等量接种到病原菌3 mm处的四个边上，重复3次，以接种灭菌水作为对照。

1.4.3  3株内生菌挥发物对棉花枯萎病菌拮抗试验。

原真菌培养采用无隔板平板皿进行拮抗试验。有隔板的平皿是中间利用隔板将平皿一分为二，培养基和菌都不能通过隔板，只有隔板两边的菌产生的挥发物才可以。

采用有隔板平板皿平板对峙法［13］，用直径2.5 mm的打孔器打出棉花枯萎病病菌菌饼，并将菌饼接种至倒满PDA培养基的隔板培养皿的一边，并在26 ℃的培养箱倒置培养4 d，第4天对3株内生菌摇菌并离心处理，倒掉上清液往沉淀的内生菌加同等量的灭菌水，摇晃将灭菌水和沉淀混勻制备菌悬液，并把菌液同等量接种到隔板培养皿的另一边，重复3次，以接种灭菌水作为对照。

拮抗率=对照组病原菌菌落直径－处理组病原菌菌落直径/对照组病原菌菌落直径×100％。

1.4.4  3株内生菌拮抗棉花枯萎病菌的形态观察和回接培养。

用接种针在菌丝边缘挑取少量菌丝制成临时玻片，放于光学显微镜下观察其菌丝形态特征，并采集图片。

采用传统接种法［12］将被拮抗的棉花枯萎病菌菌饼接种至倒满PDA培养基，在26 ℃下倒置培养6 d，观察其生长速度并验证3株内生菌对棉花枯萎病菌是否抑制生长或杀死。

2  结果与分析

2.1  3株内生菌菌悬液对棉花枯萎病菌拮抗率

通过平板对峙法对棉花枯萎病菌的皿内拮抗试验结果显示（图1、图2），3株内生菌对棉花枯萎病菌拮抗效果分别是菌株O拮抗率达45%，菌株T拮抗率达38%，菌株DG3-1拮抗率达7.70%。菌株O菌悬液对棉花枯萎病菌拮抗效果最佳，菌株DG3-1对棉花枯萎病菌拮抗效果相对较弱。

2.2  3株内生菌上清液对棉花枯萎病菌拮抗率

通过平板对峙法对棉花枯萎病菌的皿内拮抗试验结果显示（图3、图4），3株内生菌上清液对棉花枯萎病菌拮抗效果分别是菌株O拮抗率达26%，菌株T拮抗率达50%，菌株DG3-1拮抗率达17%。菌株T上清液对棉花枯萎病菌拮抗效果最佳，菌株DG3-1上清液对棉花枯萎病病菌拮抗效果相对较弱。

2.3  3株内生菌菌挥发物对棉花枯萎病菌抑菌率

通过隔膜平板对峙法对棉花枯萎病菌的皿内拮抗试验结果显示（图5、图6），3株内生菌菌挥发物对棉花枯萎病菌拮抗效抑制分别是菌株O拮抗率达19%，菌株T拮抗率达32%，菌株DG3-1拮抗率达50%。菌株DG3-1对棉花枯萎病菌拮抗效果最佳，菌株O对棉花枯萎病病菌拮抗效果相对较弱。

2.4  3株内生菌对棉花枯萎病菌生长及菌丝形态的影响

通过显微镜观察菌丝形态结果显示（图7），对照菌组菌丝生长完整没有出现空腔、断裂以及溶解现象，但被3株内生菌拮抗后的菌丝出现被溶解、空腔以及断裂现象。

将靠近内生菌一侧的病原菌菌饼通过传统接种法接种至新的PDA培养皿，培养6 d后发现被内生菌拮抗过的病原菌仍能生长，生长速度较对照组慢。3株内生菌菌悬液只能延阻其生长但不能杀死棉花枯萎病病菌（图8）。

3  结论与讨论

尖孢镰刀菌是一种能够引起植物枯萎病和根腐病的土传病原真菌，严重影响植物产量和品质，造成巨大的经济损失［8］。贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌是应用最广泛菌种。研究表明芽孢杆菌对黄瓜枯萎病［13-14］、番茄枯萎病［15］、棉花枯萎病［16］、草莓枯萎病［17］、香蕉枯萎病［18］等多种病原菌具有一定程度的拮抗效果。

3株内生菌菌悬液对棉花枯萎病菌拮抗率分别为菌株O为45%，菌株T为38%，菌株DG3-1为7.70%；杨迪等［19］证实解淀粉芽孢杆菌对尖孢镰刀菌有较显著的拮抗作用。3株内生菌上清液对棉花枯萎病菌的拮抗率分别为菌株O为26%，菌株T为50%，菌株DG3-1为17%；许帅等［20］研究发现贝莱斯芽孢杆菌发酵上清液能够有效抑制马铃薯枯萎病

菌。宗英等［21］研究表明贝莱斯芽孢杆菌IS25R发酵滤液

对禾谷镰刀菌的菌丝生长和分生孢子萌发的抑制率分别达

27.7%和26.7%。3株内生菌挥发物对棉花枯萎病菌的拮抗

率分别为菌株O为19%，菌株T为32% ，菌株DG3-1为50%；关于内生菌挥发物对尖孢镰刀菌的拮抗作用研究鲜见报道，后需对挥发性抑菌机理深入研究。

显微镜观察菌丝形态结果显示，被3株内生菌抑制过的棉花枯萎病菌菌丝出现、被溶解、空腔以及断裂现象。重新培养被抑制过的枯萎病菌结果显示，被抑制过的棉花枯萎病菌可以正常生长但生长速度较慢。研究表明［22-23］芽孢杆菌对尖孢镰刀菌具有分解真菌细胞壁、引起菌丝变短、菌体膨大以及抑制孢子萌发等能力。该研究证实了解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌以及根瘤菌，菌悬液、上清液以及菌挥发物均对尖孢镰刀菌引起的棉花枯萎病菌有不同程度的拮抗作用，为后期制备生物菌剂提供理论基础以及菌种资源。

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