不同贮存方法对紫花苜蓿种子内生根瘤菌数量变化的影响

金晓玲

（庆阳市畜牧技术推广中心，甘肃 庆阳 745000）

紫花苜蓿属豆科植物，根瘤菌可与其共生形成根瘤，这一共生体系的共生固氮作用不仅具有巨大的经济和社会效益，同时在改善生态环境等方面具有重要意义。苜蓿多采用种子繁殖，种子用量很大但不耐贮藏（Lopez et al,2001)。已报道苜蓿种子内携带根瘤菌，但由于储藏时温度及储藏方式等，常常会影响到种带根瘤菌数量。因此，适应的贮藏温度利于体内根瘤菌的繁殖。此外，种子含水量也会影响种子活力。霍平慧等（2011）采用硅胶室温干燥法对陇东紫花苜蓿进行了超干处理，使种子含水量由9.03%(CK)分别降至7.09%、6.93%、6.36%、5.72%、5.46%、5.18%、4.97%和4.59%，4.59%；之后将种子用双层铝箔纸密封，置于盛满硅胶的干燥皿中，室温(23～26℃)下贮藏一年，结果显示不同程度的干燥脱水对种子活力有显著影响。虽然国内外对温度或者含水量对种子生长影响有所研究，但是对于温度和含水量两者相互交叉作用对种子根瘤菌影响的研究报道目前尚少。

因此，本试验以含根瘤菌的紫花苜蓿种子为试验材料，分别用不同温度和包装条件贮存，研究种子内根瘤菌存活和增殖的适宜条件，通过不同保存方式对含根瘤菌种子内根瘤菌增殖的影响，继而筛选出最适保存条件，为获得含有大量根瘤菌的苜蓿种子奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘农5号紫花苜蓿(medicago sativa L.Gannong No.5) 在结荚期以切主根浇灌、根部直接浇灌、加入600 mg/ml苦参碱（浓度1.3%）浇灌三种接种方法接种两种荧光标记根瘤菌（Sinorhizobium meliloti.12531f（S.12531f）和 Rhiz obium meliloti.GN5f（R.GN5f）。结荚期收获种子，未进行标记根瘤菌接种的处理为对照。室内风干2个月进行不同方法的贮存。

1.2 试验方法

1.2.1 含荧光标记根瘤菌种子的贮存 根瘤菌生长的临界低温值为-10℃（祁娟，2006），最高适应生长温度为28℃，因此本次设定25℃（室温），4℃（低温），-4℃（超低温），采用铝箔纸（种子用铝箔纸密封包装)、信封加布袋（种子装于布袋内，外加信封袋）、信封袋3种包装方式贮存处理；以用纸质信封袋包装后置于有干燥硅胶的干燥器内在室温下贮存处理为对照，贮藏6个月后测定种子内生根瘤菌数量。

1.2.2 种子内根瘤菌数量的检测 贮存6个月后随机挑选各处理种子25粒，重复4次，放入50 ml无菌三角瓶内，加入碘伏消毒液(有效碘浓度为2500 mg/L)淹没浸泡消毒3 min后无菌水冲洗5次，至三角瓶内无泡沫状液体出现。以上均在无菌环境内进行。表面消毒后，将最后一次消毒的植物器官各面在培养基平板上印一下，28℃条件下培养24 h，观察有无菌落产生，以验证消毒是否彻底。若有菌落长出则再次消毒(迟峰,2006)。消毒后的种子各部位置于无菌研钵中，加入2 ml无菌水研磨，研磨液离心（4 000 rpm/min，2 min）后依次吸取0.2 ml上清液均匀涂布于含刚果红YMA固体培养中，28℃培养24 h后黑暗中记录每培养皿中根瘤菌单菌落数量。（刚果红YMA培养基中，根瘤菌形态为含有粘质胞外多糖且不吸附色素的白色半透明菌落，形态为平坦凸起或半透明凸起，边缘光滑）（霍平慧,2014）。

1.3 数据处理

用Excel2007软件进行数据整理，SPSS20.0.0软件进行统计和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 常温（25℃）不同贮存方法对不同处理种子内生根瘤菌数量的影响

如图1所示，常温信封贮存条件下，G切种子的保存效果最好，根瘤菌数量数量最多，达到380.0/cfu·25粒-1，与铝箔和信封+布袋的贮存条件相比，差异显著；G浇处理铝箔贮存条件下内生根瘤菌数量显著高于其他两种包装材料，数量为197.5/cfu·25粒-1；1浇在信封和铝箔贮存条件下数量显著高于信封+布袋处理，但二者之间差异不显著；CK种子在铝箔包装条件下效果好，达260.5/cfu·25粒-1，显著高于其他两种处理。其余不同处理不同包装材料间种子内生根瘤菌数量无显著性差异。

图1 常温（25℃）不同贮存方法下不同处理种子内生根瘤菌数量变化

2.2 常温（25℃）干燥不同贮存方法对不同处理种子内生根瘤菌数量的影响

如图2所示，常温（25℃）干燥信封+布袋保存条件下，1浇种子保存效果最好，内生根瘤菌数量显著高于其他处理，数量达1021/cfu·25粒-1。G切在铝箔贮存条件下根瘤菌数量显著高于其他两种包装方法，达332.0/cfu·25粒-1；G浇处理内生根瘤菌数量在信封包装条件下显著高于其他处理，达552/cfu·25粒-1；G+苦在信封包装条件下内生根瘤菌数量显著高于其他两种处理，数量为385.0/cfu·25粒-1；CK种子内生根瘤菌数量最少，仅为58.5/cfu·25粒-1，且三种包装材料间无显著性差异。

图2 常温（25℃）干燥不同贮存方法下不同处理种子内生根瘤菌数量变化

2.3 4℃不同贮存方法对不同处理种子内生根瘤菌数量的影响

如图3所示，在4℃铝箔包装条件下1浇种子内生根瘤菌数量显著高于其他处理，数量达259.5/ cfu·25粒-1。G切处理各包装材料间无显著性差异；G浇在信封贮存条件下内生根瘤菌数量显著高于另两种材料，为136.0/cfu·25粒-1；其余四种处理不同包装材料间差异不显著。

图3 4℃不同贮存方法下不同处理种子内生根瘤菌数量变化

2.4 -4℃不同贮存方法对不同处理种子内生根瘤菌数量的影响

如图4所示，-4℃下，G切种子在信封贮存条件下根瘤菌数量最多达638.5/cfu·25粒-1，显著高于其它两种包装材料；G+苦铝箔保存条件下根瘤菌数量达625.0/cfu·25粒-1，显著高于其他两种包装处理；1切和1浇在铝箔包装条件下数量最高分别为374.5/cfu·25粒-1和312.0/cfu·25粒-1，但与信封+布袋无显著性差异；G浇/1+苦和CK各包装材料间差异不显著，最多分别为305.5/cfu·25粒-1、213.5/cfu·粒-1和73.5/cfu·25粒-1。

图4 -4℃不同贮存方法下不同处理种子内生根瘤菌数量变化

3 讨论

适宜的贮藏温度和良好的贮藏条件是种子内生根瘤菌繁殖的关键因素。每种微生物都有其适宜的生长温度范围。本试验在4℃贮存时各处理种子内生根瘤菌最高数量均低于其他三个温度的贮存数量，以25℃干燥信封+布袋贮存1浇种子内根瘤菌数量最多，由此说明选取的三种温度均未达到根瘤菌生长最低限，但因种子外包装材料及菌种特性从而影响种子内生根瘤菌的繁殖。

含水量是保持种子活力和生活力的关键因素之一。已有研究认为贮藏种子含水量低于5%，将导致种子活力下降(Buitinket al,1999;McDonald ,1999)。本研究发现25℃贮存时，干燥条件除G切和对照外，各处理种子内根瘤菌数量均高于未干燥处理，由此表明水分同样影响种子内根瘤菌的繁殖。

相同温度贮存条件下，不同包装材料对不同处理种子内根瘤菌数量影响不同。常温时，信封贮存G切种子效果明显优于其他两种包装材料，铝箔贮存G浇和CK种子效果明显优于其他两种包装材料，其余处理不因包装材料不同而不同；25℃干燥时，铝箔贮存G切，信封贮存G浇、G+苦种子，信+布贮存1浇种子时效果明显优于其他两种包装材料，4℃铝箔贮存1浇种子时效果明显优于其他两种包装材料，-4℃时铝箔贮存G切和G+苦种子时效果明显优于其他两种包装材料，其余各包装材料在相同温度下并未影响种子内根瘤菌数量。由此表明包装材料对内生根瘤菌数量的影响因温度不同而不同，进而表明温度和含水量是共同影响种子内根瘤菌存活的因素。

本试验中，适宜种子内生根瘤菌增殖的温度为25℃干燥或-4℃，表明接种根瘤菌后苜蓿种子适宜在常温干燥或低温环境下贮存，但由于种子贮存过程中含水量较难控制，环境会影响含水量的变化，因此，生产实践中-4℃更利于种子的贮存，而该温度下，铝箔包装材料下种子内根瘤菌数量较多。

因此，从生产实践及种子贮存的方便性考虑，-4℃铝箔纸密封保存更利于种子内根瘤菌的增长和繁殖，但利于更多根瘤菌在种子内繁殖并获得稳定高产植株的种子贮存条件仍有待于进一步研究。

4 结论

温度和水分共同影响紫花苜蓿种子内根瘤菌的繁殖，综合生产实践条件，得出-4℃更利于根瘤菌在种子内繁殖；铝箔保存效果优于信封和信封+布袋。