一例马匹发生疑似饲料生物毒素中毒的诊断

潘 红，罗斌汉，罗千慧，赵睿明，孙雨琪，岑曼益，侯俊达，蔺国珍

（西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

2018年4月青海某地养殖户的一匹黑马发生突然死亡，病发突然，畜主怀疑是由于饲喂了仓库中的小麦引起的。据现场解剖变化为心脏淤血水肿，肝脏组织变性，切面呈土黄色，肺脏淤血水肿。由于该病原因不明、争议较大，先后送检到有关部门进行诊断，还无法对马匹的死亡原因做出确切的诊断。最后畜主将当天购买和死亡马匹所食的饲料送来进行实验室检测，现将检测结果总结如下。

1 材料与方法

1.1 送检样品

马槽中饲喂剩下的小麦，仓库中保存的小麦，塑料袋密封保存经运输送到实验室4℃保存备用；榆中县市场购买干净的、无异常的食用小麦。

1.2 试验动物

法国伊拉兔（獭兔）12只，体重为1.8～3.75 kg，健康状况良好。小白鼠24只，体重18～22 g，健康状况良好，采购自兰州兽医研究所。对所有试验的动物提前7 d饲喂观察，证明健康无病后作为试验动物备用。

1.3 家兔饲喂试验

将12只健康的家兔分为三组，每组4只，其分组如下：第1组，即组Ⅰ，饲喂马槽中饲喂剩下可疑小麦，第2组，即组Ⅱ，饲喂仓库中的小麦，对照组则饲喂购自榆中县市场小麦。以上3组家兔每天检测其体温变化，每只每日饲喂小麦50 g，其余饲料为同一类型干净的青干草，在相同条件下笼中隔离饲养，自由饮水，保持笼中干净清洁，每日观察精神食欲和死亡等情况。如有死亡情况，观察其组织脏器有无病理变化。

1.4 病原微生物学检查及动物接种试验

选取1.3中最先死亡家兔的肝脏触片，并对触片进行革兰氏染色和瑞特氏染色，在光学显微镜下观察有无细菌。将死亡兔肝脏、心血分别涂布接种于营养琼脂平板置于37 ℃培养箱培养24 h，观察有无菌感染。如果有菌生长，挑取平板中单个菌落分别接种于营养琼脂斜面进行纯培养，再将纯培养物接种于10%的血清营养肉汤振摇培养，200 r/min，在37 ℃培养24 h，对试管中纯培养的菌落分别进行革兰氏染色和瑞特氏染色，并在光学显微镜下观察。

用死亡兔肝脏中纯分离出来的菌株的肉汤培养物对小鼠进行腹腔注射，每株菌各用4只小白鼠，每只0.5 ml，同时设4只小白鼠作为对照组，用无菌的肉汤每只腹腔注射0.5 ml。每天对小鼠的情况进行观察，持续观察5 d。

1.5 饲料中疑似含有生物毒素的动物试验

将来源相同，年龄、体重基本相同的10只健康小白鼠分为两组，每组5只。试验组即将马槽中饲喂剩余的饲料用1：5的PBS在旋涡振荡仪振荡5 min后，5 000 r/min离心5 min，吸取上清液加入双抗至最终浓度为1 000 U/ml，在37 ℃培养箱中作用1 h，给试验组小白鼠尾静脉注射0.8 ml；对于条件相同对照组小白鼠，用新购买的小麦，使用与试验组相同的方法获取上清液，分别对小白鼠尾静脉注射0.8 ml。两组小白鼠在笼中隔离饲养，饲喂方法和饮水相同，每天观察和记录其精神食欲及死亡的情况，连续观察7 d。

2 结果

2.1 家兔饲喂试验

在家兔饲喂试验期间，三组家兔观察的情况见表1。三组家兔的体温未见升高，组Ⅰ中家兔3 d内的精神状况良好，食欲正常，从第4 d起组Ⅰ的精神食欲状况开始降低，且有一只的食欲废绝，在第5 d的时候1号家兔死亡，其他3只家兔精神沉郁，食欲废绝，第7 d时2号家兔死亡，观察至第8 d，组Ⅰ中的家兔全部死亡。在8 d内组Ⅱ和对照组的家兔都精神状况良好，没有出现一例死亡。

表1 家兔精神食欲和死亡情况

死亡的4只家兔经尸体剖检，眼观表现如下：嘴唇发青，肝脏呈蓝紫色，淤血，质地脆，切开肝门静脉，血液凝血不良；胆囊肿大；有一只家兔的脾脏肿大；胃内容物呈液性鼓胀，内容物稀薄，部分内膜脱落；十二指肠下端充血、出血，肠壁变薄；心肌松软，右心扩张松软，冠状血管淤血；肺脏淤血，膈叶有坏死灶；脾脏无明显变化；肠系膜淋巴结有两只肿胀；膀胱有一只有积液；气管和喉管黏膜充血。

2.2 死亡家兔病原微生物检查及致病性试验

最先死亡的1号和2号兔的肝脏触片经染色后，如图1所示，镜检发现疑似有少量的瑞特氏染色呈蓝紫色的杆菌。两只死亡家兔的肝脏、心血培养中在平板上长出灰白色中等大小的菌落，表面隆起，边缘整齐，较为光滑，在10%的血清营养肉汤中培养24 h后，肉眼观察浑浊，底部有沉淀。肉汤中的培养物发现有革兰氏阴性形态一致的杆菌（图2）。

用死亡兔肝脏中纯分离出来的肉汤培养物腹腔接种小白鼠后，试验组小白鼠和对照组小白鼠均未见死亡。

图1 肝脏触片的细菌（瑞特氏染色，×1000）

2.3 饲料中生物毒素的初步检测

饲料上清液对小白鼠试验结果为：试验组即马槽饲喂剩余的小麦脱洗下的上清液，5只小白鼠经一周的观察，3只死亡（死亡率为60%），对照组未发现死亡。

图2 肉汤培养物中的细菌（革兰氏染色，×1000）

3 讨论

据调查发现，国内对于马属动物中毒的研究相对较少，较多在饲喂了含有发霉的粮食，或误食、多食含有毒素的食物导致出现中毒及死亡[1-7]。刘志强报道了新疆奇台县马的死亡病例，在牧民家中，马匹突然发病，倒地身亡。根据临床症状和解剖诊断，得知是牧民给马饲喂了霉变的玉米导致的[8]。还有报道称马在误食中药蓖麻籽后，导致碳水化合物代谢紊乱产生中毒死亡现象[9]。在本研究中，将马槽中的小麦饲喂实验动物家兔后，家兔全部死亡；饲喂小麦的洗脱液在尾部静脉注射小鼠后，死亡率为60%，而且对照组的新鲜小麦无一例出现死亡，表明马是由于饲喂了含有不明毒素的小麦而导致死亡的。实验中的家兔的体温正常，没有出现升高，死亡后的家兔病理解剖学检查有病变，但微生物分离培养及分离菌的小白鼠致病性试验尚未观察到所分离的菌有致病性，表明其不是导致动物死亡的致病菌。在肝脏触片和接种过程中，也可能由于操作的失误，而使检查中出现细菌。而且动物一般在细菌病毒等感染后，其体温会出现升高，根据这一特点推断，马槽中饲喂的饲料中不含具有致病性的细菌。据蔡葵蒸等报道，家兔在饲喂了含有变质肉骨粉的饲料时出现爆发性死亡，变质的肉骨粉中含有肉毒梭菌，其增殖后产生的毒素引发了家兔的死亡[10]。对饲喂的饲料观察和询问畜主发现，马当天饲喂的小麦是从仓库中袋子的下层取出，其出现了变质，而且小麦周围没有其他药物和毒素出现，其他袋中的小麦在动物实验中没有出现动物死亡，认为青海地区马的死亡是由于饲喂了含有疑似生物毒素的小麦所致，在粮食保存时，仓库中闷热，封闭，杂乱潮湿的环境会导致小麦发生变质，在变质过程中产生的未知毒素是导致马死亡的关键因素。因此，在饲料的保存过程中，要注重仓库环境的干净整洁，对饲料合理保存，在变质等情况发生时要及时处理。