不同种类氨基酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响

王平 刘桂君 乔宇琛 周思静 宋梅芳 顾海科 侯莉

摘要  ［目的］研究液体培养基中添加氨基酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响，并确定8种氨基酸最佳添加浓度。［方法］考察24种氨基酸（添加浓度为1 g/L）对虫草素含量的影响，采用DPS V18.10软件进行差异显著性分析，并对促进虫草素合成作用显著的8种氨基酸添加浓度进行研究。［结果］L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、肌氨酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量具有不同程度的提高作用；4 g/L的L-甘氨酸对虫草素的合成促进作用最强，发酵液中虫草素含量为1 022.25 mg/L。［结论］该研究为蛹虫草液体发酵生产虫草素提供参考依据。

关键词  蛹虫草；虫草素；氨基酸；含量；培养基；发酵液

中图分类号  S567.3+5  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）09-0152-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.09.034

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Amino Acids on Cordycepin Content in the Fermentation Broth of Cordyceps militaris

WANG Ping1， LIU Gui-jun2， QIAO Yu-chen2 et al

（1. Beijing Academy of Science and Technology， Beijing 100089;2. National Natural History Museum of China， Beijing 100050）

Abstract  ［Objective］To study the effects of amino acids added in liquid culture medium on cordycepin content in the fermentation broth of Cordyceps militaris， and determine the optimal concentration of 8 kinds of amino acids added in liquid culture medium.［Method］The effects of 24 kinds of amino acids （adding concentration 1 g/L） on cordycepin content were studied. DPS V18.10 software was used for significant difference analysis. Adding L-lysine， L-cysteine， L-arginine， L-asparagine， L-glycine， L-alanine， L-serine， L-threonine， L-histidine and sarcosine had varying degrees of increasing effects on cordycepin content in the fermentation broth of Cordyceps militaris. 4 g/L L-glycine had the strongest promoting effect on cordycepin synthesis， and the cordycepin content in the fermentation broth was 1 022.25 mg/L. ［Conclusion］This study provides references for producing cordycepin by Cordyceps militaris liquid fermentation.

Key words  Cordyceps militaris;Cordycepin;Amino acid;Content;Culture medium;Fermentation broth

基金項目  北京市科学技术研究院创新培育项目（23CB091）；北京市科学技术研究院北科萌芽计划课题（BGS202213）。

作者简介  王平（1991—），女，北京人，工程师，从事食药用资源开发与利用研究。

*通信作者，正高级工程师，博士，从事食药用资源开发与利用研究。

收稿日期  2023-07-09

蛹虫草（Cordyceps militaris）又称北冬虫夏草，是我国传统的药食兼用真菌［1］。蛹虫草含有丰富的生物活性成分，包括虫草素、虫草酸、虫草多糖、类胡萝卜素、腺苷、N6-（2-羟乙基）腺苷及超氧化物歧化酶等［2-5］。虫草素（ Cordycepin）即3′-脱氧腺苷是蛹虫草重要活性成分之一［6］，具有抗肿瘤［7］、治疗白血病［8］、抗炎［9］、抗病毒［10］、抗肥胖［11］等生物活性作用。英国牛津大学与NUCANA生物制药公司利用ProTide技术，将5-O-phenyl-（benzyloxy-L- alaninyl）- phosphate基团连接在虫草素上，合成一种新型化疗药物NUC-7738，对晚期实体瘤患者具有很强的抗癌活性［12］，对虫草素在抗癌中的应用起到了极大的推进作用，因此研究如何提高蛹虫草中虫草素产量，获取更多的原料，对于虫草素在医药中的应用具有重要意义。

氨基酸是微生物生长过程中培养基的重要组成成分，也是微生物代谢中重要原料，会直接影响次生代谢物的合成，研究表明，氨基酸对蛹虫草中虫草素产量具有重要影响。早在2005年毛先兵等［13］研究氨基酸对液体培养蛹虫草产虫草素的影响，得出半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸等促进虫草素形成，添加20 mmol/L丝氨酸，虫草素产量最大值为211 mg/L，比对照提高26%。Masuda等［14］优化蛹虫草NBRC9787菌株液体培养条件，发现甘氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、腺嘌呤、腺苷等能促进虫草素的产生。Das等［15］在培养基中以甘氨酸替代部分酵母提取物，可以将虫草素产量提高12.40%。另有研究表明，添加丙氨酸、苯丙氨酸、L-天门冬酰胺、甘氨酸、L-谷氨酰胺、精氨酸等均可以在一定程度上促进虫草素的合成，从而提高虫草素的产量［16-22］。已有研究报道多是对其中1种或者3～5种氨基酸进行研究，研究不同添加时间、与腺苷或腺嘌呤不同配比等对蛹虫草中虫草素含量的影响，陈长兰等［21］研究20种氨基酸对蛹虫草菌丝体中虫草素含量的影响，并未对发酵液进行研究，而研究表明蛹虫草中97%～98%的虫草素分布在发酵液中，因此研究氨基酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响对于虫草素发酵生产具有重要意义。为此，该研究选定24种氨基酸，考察不同种类氨基酸和不同浓度氨基酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响，为虫草素的发酵生产提供重要参考。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  菌种。

蛹虫草（Cordyceps militaris）菌株CM11，经过离子束辐射诱变筛选得到，北京市科学技术研究院实验室保存。

1.1.2  培养基。

PDA固体培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基39 g/L，加热溶解，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 自然，121 ℃，灭菌30 min。

种子液培养基：葡萄糖30.0 g/L，胰蛋白胨4.0 g/L，酵母粉2.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4 0.5 g/L，加热溶解，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 自然，121 ℃，灭菌30 min。

基础培养基：蔗糖40.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCl2 1.0 g/L，pH自然，加热溶解，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃，灭菌30 min。

1.1.3  试剂。

葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、氯化钙等均为分析纯试剂，胰蛋白胨、酵母粉、蛋白胨等均为生物培养基级别，购自国药集团北京化学试剂公司；24种氨基酸均为生物培养基级别，购自北京酷来搏科技有限公司；虫草素为高效液相色谱纯级别，购自Sigma公司；甲醇为高效液相色谱级别，购自上海安谱实验科技公司。

1.1.4  仪器与设备。

1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦仪器公司；5424型高速离心机，德国Eppendorf公司；ZHWY-2112B双层恒温摇床，上海智诚分析仪器制造有限公司；SPX智能型生化培养箱，宁波江南仪器厂。

1.2  试验方法

1.2.1  菌种活化与固体培养。

将4 ℃冷藏箱保存的蛹虫草斜面菌种放置25 ℃生化培养箱中活化24 h，然后转接到PDA固体平板培养基中，于25 ℃生化培养箱中培养15～20 d。

1.2.2  液体培养方法。

1.2.2.1

种子液培养方法。蛹虫草PDA固体平板培养基菌种用无菌打孔器打出大小相同的接种块，挑取5块接种于装有种子液培养基的三角瓶中，放置在25 ℃恒温摇床中，设定转速为150 r/min，培养时间为5 d。

1.2.2.2

批量液体培养方法。在基础培养基中分别添加24种氨基酸，添加浓度为1 g/L，对照组为基础培养基，不添加任何氨基酸。按照5%的接种量将种子液接入装有100 mL培养基的250 mL三角瓶中，放置在25 ℃恒温摇床中，设定转速为150 r/min，培养时间为7 d。

1.2.2.3

考察不同浓度氨基酸对虫草素含量影响的方法。选取促进虫草素合成的氨基酸，分别添加到基础培养基中，添加浓度为1、2、4、8、16 g/L。其余方法与“1.2.2.2”批量液体培养方法相同。

1.2.3  发酵液中虫草素含量的测定。

1.2.3.1

虫草素标准曲线制作。准确称取0.01 g虫草素标准品，用超纯水稀释至10 mL，配制成1 000 mg/mL的标准储存液，梯度稀释，虫草素的浓度为0、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00 μg/mL。采用高效液相色谱法（HPLC）测定虫草素的含量，根据标样浓度与峰面积的关系，绘制标准曲线。

1.2.3.2

虫草素测定方法。采用高效液相色谱法（HPLC）测定，DAD检测器，检测波长为260 nm，色谱柱XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇∶纯水（V/V）15∶85，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温箱温度为25 ℃。

1.2.3.3

蛹虫草发酵液样品制备方法。取蛹虫草发酵混合物，装入离心管中，采用冷冻离心机离心，转速8 000 r/min，离心5 min后取上清液，0.22 μｍ水相无菌滤膜过滤，得到待测样品。

1.2.4  差异显著性分析。

每组样品均为3次平行，采用DPS V18.10软件对所得试验数据进行差异显著性分析。

2  结果与分析

2.1  24种氨基酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响

由表1可知，在液体培养基中添加的24种氨基酸，显著促进虫草素合成的氨基酸有8种，其中非极性氨基酸有2种，分别为L-甘氨酸、L-丙氨酸，添加这2种氨基酸能够显著提高虫草素含量，分别提高110.28和86.25 mg/L；碱性氨基酸有2种，分别为L-赖氨酸、L-精氨酸，其中添加L-赖氨酸对虫草素含量提高257.87 mg/L，效果最为显著；中性氨基酸有4种，分别为L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-天门冬酰胺，其中添加L-半胱氨酸对虫草素含量提高较为显著，提高159.56 mg/L。不同种类的氨基酸对蛹虫草中虫草素含量的提高幅度各不相同，碱性氨基酸总体上对虫草素合成具有較为明显的促进作用。在液体培养基中添加L-组氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-谷氨酰胺、L-瓜氨酸、L-焦谷氨酸和肌氨酸这7种氨基酸对提高蛹虫草发酵液中虫草素含量影响差异不显著。在液体培养基中添加L-胱氨酸和L-脯氨酸会显著抑制虫草素合成，导致蛹虫草发酵液中虫草素含量降低。在液体培养基中添加L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸和L-天冬氨酸这7种氨基酸对虫草素合成有一定的抑制作用，但效果不显著。在上述24种氨基酸中，对蛹虫草发酵液中虫草素含量提高作用最强的为L-赖氨酸，其次为L-半胱氨酸、L-精氨酸和L-天门冬酰胺。

2.2  不同浓度氨基酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响

根据各种氨基酸对虫草素含量影响的试验结果，选取对虫草素含量提高幅度最为显著的8种氨基酸，分别为L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸，将其按照不同浓度添加到蛹虫草液体培养基中，考察不同浓度氨基酸对虫草素含量的影响。

2.2.1  不同浓度L-赖氨酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。

从图1可以看出，L-赖氨酸浓度对蛹虫草发酵液中虫草素含量影响较大，添加1和2 g/L的L-赖氨酸促进虫草素合成，从而提高发酵液中虫草素含量，含量分别为846.20和656.22 mg/L；添加4 g/L的L-赖氨酸后开始抑制虫草素的合成，虫草素含量迅速降低，添加8和16 g/L的L-赖氨酸时虫草素含量降低为106.60和7.81 mg/L。由此可知，高浓度的L-赖氨酸对蛹虫草中虫草素的合成抑制作用非常显著，所以考察不同浓度的L-赖氨酸对虫草素含量的影响对于发酵参数优化具有重要意义，L-赖氨酸的最适添加浓度为1 g/L，可以有效提高蛹虫草发酵液中虫草素含量。

2.2.2  不同浓度L-半胱氨酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。

从图2可以看出，随着L-半胱氨酸添加浓度的增加，蛹虫草发酵液中虫草素含量逐渐降低；添加1 g/L的L-半胱氨酸能够促进虫草素的合成，虫草素含量为749.70 mg/L；添加2 g/L的L-半胱氨酸后开始抑制虫草素的合成，虫草素含量逐渐降低；添加16 g/L的L-半胱氨酸时虫草素含量降低为248.84 mg/L。由此可知，高浓度的L-半胱氨酸对蛹虫草中虫草素的合成具有显著抑制作用，因此L-半胱氨酸的最适添加浓度为1 g/L，可以将蛹虫草发酵液中虫草素含量提高27.93%。

2.2.3  不同浓度L-精氨酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。

从图3可以看出，随着在液体培养基中添加L-精氨酸的浓度增大，蛹虫草发酵液中虫草素含量不断降低。添加1 g/L的L-精氨酸能够提高发酵液中虫草素含量；添加2和4 g/L的L-精氨酸开始抑制虫草素的合成；添加8 g/L的L-精氨酸时虫草素含量为228.65 mg/L，已经降低为对照的39.02%；而添加16 g/L的L-精氨酸时虫草素含量低至7.60 mg/L，比对照减少了98.70%。因此，高浓度的L-精氨酸严重抑制虫草素的合成，L-精氨酸的最适添加浓度为1 g/L，虫草素含量为736.62 mg/L。

2.2.4  不同浓度L-天门冬酰胺对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。

从图4可以看出，添加1～8 g/L的L-天门冬酰胺对蛹虫草发酵液中虫草素含量具有提高作用，提高的幅度与添加L-天门冬酰胺的浓度呈负相关，即添加L-天门冬酰胺的浓度越大，虫草素含量提高的幅度越小；添加1 g/L的L-天门冬酰胺对虫草素的提高效果最为显著，虫草素含量提高142.49 mg/L；添加16 g/L的L-天门冬酰胺抑制虫草素的合成，虫草素含量为509.11 mg/L，比对照降低76.87 mg/L。因此，L-天门冬酰胺的最佳添加浓度为1 g/L，发酵液中虫草素含量为728.47 mg/L。

2.2.5  不同浓度L-甘氨酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。

从图5可以看出，蛹虫草发酵液中虫草素含量随着L-甘氨酸添加浓度的增加先升高后降低；添加4 g/L的L-甘氨酸时发酵液中虫草素含量最高，比对照提高436.27 mg/L；添加1、2和8 g/L的L-甘氨酸对发酵液中虫草素含量具有不同程度的提高；添加16 g/L的L-甘氨酸对虫草素的合成具有一定的抑制作用，导致虫草素含量降低19.16 mg/L。因此，L-甘氨酸的最适添加浓度为4 g/L，发酵液中虫草素含量为1 022.25 mg/L，比不添加氨基酸的发酵液中虫草素含量提高74.45%，提高效果明显。

2.2.6  不同浓度L-丙氨酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。

从图6可以看出，添加1～16 g/L的L-丙氨酸均可以提高发酵液中虫草素含量，随着添加浓度的增大，虫草素含量先提高后降低，但总体是促进虫草素的合成，提高虫草素的含量。添加8 g/L的L-丙氨酸时发酵液中虫草素含量最高，比对照提高247.16 mg/L；添加16 g/L的L-丙氨酸时发酵液中虫草素含量为609.70 mg/L，虽然比添加8 g/L时的含量降低，但与对照相比，仍然对虫草素含量具有提高作用，提高23.72 mg/L。因此，L-丙氨酸的最适添加浓度为8 g/L，发酵液中虫草素含量为833.14 mg/L，比对照发酵液中虫草素含量提高42.18%。

2.2.7  不同濃度L-丝氨酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。

从图7可以看出，添加不同浓度的L-丝氨酸可以促进虫草素的合成，也可以抑制虫草素的合成；添加1～4 g/L的L-丝氨酸可以提高发酵液中虫草素含量；添加8～16 g/L的L-丝氨酸会降低发酵液中虫草素含量；在添加1 g/L的L-丝氨酸时发酵液中虫草素含量最高，为654.63 mg/L，比对照提高11.72%。

2.2.8  不同浓度L-苏氨酸对蛹虫草发酵液中虫草素含量的影响。

从图8可以看出，蛹虫草发酵液中虫草素含量随着L-苏氨酸添加浓度的增加先升高后降低，添加1和2 g/L的L-苏氨酸可以促进虫草素的合成，从而提高发酵液中虫草素含量；添加4～16 g/L的L-苏氨酸会抑制虫草素的合成，从而降低发酵液中虫草素含量。添加2 g/L的L-苏氨酸时发酵液中虫草素含量最高，为667.64 mg/L，比对照提高13.94%。

3  结论与讨论

在考察的24种氨基酸中，添加浓度为1 g/L时，对蛹虫草发酵液中虫草素合成促进作用最强的为L-赖氨酸，虫草素含量为846.20 mg/L，这与文献报道添加赖氨酸可以促进虫草素合成、提高菌丝体中虫草素含量的结果相似［18，21］。该研究还发现1 g/L 的L-半胱氨酸对虫草素含量提高作用也较为显著，这与文献报道添加1 g/L 的L-半胱氨酸会降低虫草素的含量［16］不一致，分析可能与菌株不同有关，不同的菌株对氨基酸的利用能力不同。1 g/L 的L-精氨酸对虫草素含量提高作用仅次于L-赖氨酸和L-半胱氨酸，这与文献报道添加2 g/L的精氨酸可以提高菌丝体中的虫草素含量［18］的结果相似。在蛹虫草培养基中添加甘氨酸的研究较多，研究表明添加1、5和14 g/L甘氨酸可以促进蛹虫草中虫草素的合成，对其产量具有不同程度的提高作用［15，16-17，19-20］。

该研究发现1 g/L的L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸和L-苏氨酸這8种氨基酸对蛹虫草发酵液中虫草素合成均有显著促进作用，对提高虫草素含量的影响程度各不相同；L-组氨酸、肌氨酸、L-焦谷氨酸、L-瓜氨酸、L-甲硫氨酸、L-谷氨酰胺和L-缬氨酸这7种氨基酸对提高蛹虫草发酵液中虫草素含量有一定程度的影响，但差异不显著；L-酪氨酸、L-异亮氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-胱氨酸和L-脯氨酸这9种氨基酸对虫草素合成有一定的抑制作用，影响程度各不相同。在对氨基酸添加浓度考察时发现，添加4 g/L的L-甘氨酸对虫草素的合成促进作用最强，发酵液中虫草素含量达到1 022.25 mg/L。该研究为蛹虫草液体发酵生产虫草素提供可靠的数据参考，对液体培养基中氨基酸的选择具有指导意义。

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