葛属植物-根瘤菌共生体的研究进展

胡书娟，詹庆才，刘 璐

（1.湖南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；2.湖南省农业生物技术研究所， 湖南 长沙 410125）

葛属（Pueraria）是豆科蝶形花亚科下的一个属，为蔓生性、多年生落叶藤本植物[1]。目前该属约35种植物，包括野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]、粉葛[Pueraria thomsonii（Benth.）]、三裂叶野葛[Pueraria phaseoloides（Roxb.）Benth.]、黄毛萼葛（Pueraria calycina Franch.）、密花葛（Pueraria alopecuroides Craib）、小花 野葛（Pueraria stricta Kurz）等[2]。我国葛属植物有12种，广泛分布于除新疆、青海及西藏外的其他地区，具有适应性广、生长快、抗逆性强、耐瘠薄等特性[3]。葛藤萌芽及生长能力强，枝叶繁茂，根系发达，是优良的水土保持植物和畜禽饲料[4]。其肥大块根称为葛根，富含优质淀粉和黄酮类物质，具有很好的保健功能，被列入药食同源的天然植物名单，是世界上重要的粮食替代作物之一[5]。

葛属植物能够与根瘤菌建立共生关系，通过生物固氮作用改善土壤结构、提高土壤肥力[6]，适于作为先锋植物应用于重金属污染土壤的修复和退化生态系统的植被恢复[7-8]。近年来，葛根在中药材提取和食品加工领域的应用比例大幅度上升，其栽培面积随之增加[2]。然而，目前对于葛属植物共生根瘤菌的认识远远不够。深入开展葛属植物-根瘤菌共生体的研究，挖掘优良的根瘤菌种质资源，对于充分发挥葛属植物的经济价值和生态功能具有重要意义。因此，笔者梳理了国内外葛属植物-根瘤菌共生体的研究进展，并结合个人的研究工作展望了未来该领域的发展方向。

1 葛属植物根瘤菌的资源调查

根瘤菌资源调查是开展根瘤菌分类及遗传多样性、生物地理分布格局等研究的重要基础，同时能够发掘新的根瘤菌资源应用于农业、林业和牧业中。近30 a 来，陈文新院士及其团队等对我国30 多个省市不同生态环境下的豆科植物进行全面地资源调查及系统地分类分析，获得上万份豆科植物根瘤标本，其中以大豆根瘤菌的资源调查及研究最为全面、系统[9-10]。虽然葛属植物广泛分布于我国各地，但对其根瘤菌资源的调查和研究还远远不够。从已有的文献看，以野葛根瘤菌的调查和研究较多，资源调查范围涵盖重庆、四川、贵州和广西等地，包括了黄壤、紫色土和石灰 土等土壤类型（表1）。

表1 葛属根瘤菌及其根瘤内生菌的遗传多样性

根瘤一般长在侧根上，须根多的植株根瘤数量也较多[12,15,18-19]。根瘤直径常在1～5 mm 之间，其大小与土壤的疏松度、湿度等密切相关；根瘤颜色多为浅褐色和淡黄色，根瘤形状以球形最为常见，偶见珊瑚状、姜状和柱形[12]。葛藤须根系发达，其结瘤数量很多，且固氮效率较高，因此固氮总量非常可观[20]。粉葛、三裂叶野葛的根瘤菌资源调查较少，其结瘤特征与野葛基本一致[21-22]；密花葛、小花野葛等其他种的根瘤菌资源调查暂未见报道。

在根瘤菌资源研究中，主要采用2 种方式进行采样调查及研究。一种方法是广泛采集某地理区域或生态区内来自不同宿主植物的根瘤样品，以了解该研究区域根瘤菌多样性等[12,15-16]；另一种方法是采集来自不同地域的来源于同一植物的根瘤样品，以用于根瘤菌生物地理学研究、根瘤菌与宿主之间的协同进化 等[23-25]。由于葛属植物根瘤菌资源调查难度远大于栽培豆科作物根瘤菌资源调查，现有的葛属根瘤菌资源调查多局限于单一地理区域，缺乏不同地理区域或生境内葛属根瘤菌的比较研究。另外，在栽培种与野生种之间，与葛属植物共生的根瘤菌是否存在差异，也有必要开展更多的调查研究。

2 葛属植物-根瘤菌共生体的遗传多样性

根瘤菌物种的准确鉴定是进行根瘤菌遗传多样性研究的基础，根瘤菌分类方法从以宿主植物为中心的“互接种族”的传统分类逐步发展到研究“系统发育关系”的现代系统分类[9]。根瘤菌多属于α-和β-变形菌纲，包括Rhizobium（根瘤菌属）、Sinorhizobium（中华根瘤菌属）、Mesorhizobium（中慢生根瘤菌属）、Bradyrhizobium（慢生根瘤菌属）和Burkholderia（伯克氏菌属）等[26]。根瘤菌的遗传分群主要采用多相分类方法，广泛使用的技术手段有基因组指纹图谱分析、特定基因序列分析、DNA-DNA 杂交、G+C mol%及多位点序列分析（MLSA）等[27]。Konstantindis 等[28]提出以基因组平均核苷酸一致性（ANI）作为新的细菌种分类标准，Zhang 等[29]发现依据3 个核心基因（SMc00019，thrA，truA）计算的ANI 值在95%或96%水平上可以将根瘤菌鉴定到种。

国内外对根瘤菌的分类与系统发育研究取得了较大的进展，但葛属植物根瘤菌的系统发育研究仍处于起步阶段[27-30]。从已有的文献来看，葛属植物能与多个属种的根瘤菌建立共生关系，如Rhizobium、Bradyrhizobium 和Mesorhizobium。野葛能与这3 个属的多个种共生，而采集自四川的粉葛与Mesorhizobium 共生，采集自喀麦隆东部的三裂叶野葛与Bradyrhizobium 共生。由此可见，葛属根瘤菌具有丰富的遗传多样性（表1）。来源于不同区域、不同土壤条件的葛藤共生根瘤菌种群存在差异，表明葛藤根瘤菌可能存在显著的生物地理学分布格局[11,13-14,17]。课题组前期对采集于桂西北喀斯特区（碱性石灰土）和湖南红壤丘陵区（酸性土）的野葛根瘤进行研究，发现与野葛共生的根瘤菌均属于慢生根瘤菌属的多个种[15]。但是，分离自相近地点的野葛根瘤菌的亲缘关系也较近，表明根瘤菌种群分布可能受地理距离的影响。目前，葛属根瘤菌的系统发育研究多通过16S rDNA 基因序列来确定其属的分类地位，无法准确鉴定到种。在今后的研究中，有必要通过多基因序列分析、全基因组序列比较来确定葛属根瘤菌种的分类地位。另外，共生基因的水平转移是根瘤菌物种多样性形成的主要原因[31]，需要加强葛属根瘤菌的核心基因与共生基因（nodC、nifH 等）的研究，以揭示葛属根瘤菌的进化历史，为建立葛属植物-根瘤菌的高效共生体提供理论依据。

豆科植物根瘤内存在许多非共生细菌，包括土壤杆菌、假单胞菌和芽孢杆菌等[10,32]。葛属植物根瘤内除了有能共生的根瘤菌外，还包括一些不具有结瘤能力的非共生根瘤菌和其他根瘤内生菌[14,17]。非共生与共生根瘤菌之间存在竞争关系，而且在植物根际共生基因横向转移过程中存在基因受体与供体的关系。Boonsnongcheep 等[14]从Pueraria candollei 根瘤中分离到一株非共生根瘤菌，经鉴定为根瘤菌属的一个新种，该菌株在回接试验中无法让宿主结瘤，且根瘤DNA 扩增不出nifH 基因和nodC 基因。另外，已发现的葛属植物根瘤内生菌包括Pseudomonas koreensis、Herbaspirillum huttiense 和Bacillus thuringiensis 等，其中部分内生菌对宿主植物具有促生作用[12,17]。已有研究表明，在豆科植物根瘤内，可能存在共生固氮基因从共生菌向内生菌水平横向转移的现象[31]。通过对内生菌-根瘤菌-葛属植物相互作用的研究，有助于人们理解葛属植物根瘤菌的起源和进化，也为科学利用这些内生菌的生态作用提供理论依据和应用基础。

3 葛属植物-根瘤菌共生体的固氮效率

根瘤菌-豆科植物共生固氮作用受根瘤菌、宿主植物和土壤环境的共同影响。耕作方式（如免耕）通过影响土壤养分、物理性质等间接影响豆科植物-根瘤菌共生体的固氮作用[33]。宿主植物的根际分泌物会影响根瘤菌的侵染和土壤养分的有效性等[34]；土壤环境主要包括土壤pH 值、水分、质地和营养元素等，影响根瘤形成、发育及固氮酶活性等[35-36]。土壤过酸（pH 值＜5.0）或过碱（pH 值＞8.5）均会严重抑制根瘤菌结瘤和固氮[37]；水分是限制根瘤菌侵染、结瘤和固氮的主要因子，在干旱胁迫条件下根瘤菌中参与氧化应激反应的基因表达上调[38]；盐胁迫使豆科植物根毛变形，从而降低根瘤菌的侵染率及固氮效率[39]；在氮素水平高的土壤中存在着“氮阻遏”现象，氮作为信号分子影响共生固氮基因的功能从而抑制共生固氮过程[40]。另外，铁元素影响血红蛋白、固氮酶等与共生固氮密切相关功能蛋白的合成，进而影响共生固氮效率[41]。

共生固氮的测定方法主要有氮累积法、乙炔还原法、15N整合法、同位素稀释法和15N自然丰度法5种[42]。乙炔还原法是最常用的方法，原理是利用固氮酶能将空气中的N2还原为NH3，也能将乙炔还原为乙烯的特点，通过测定乙烯产生速率计算固氮效率。该法特点是操作简单、成本低、灵敏度高[43]。15N 自然丰度法利用固氮与非固氮植物氮同位素特征的自然差异估算固氮速率[44]。该法优点是不需收集根瘤，仅需收集叶片材料；缺点是固氮植物和非固氮参考植物间15N丰度的差异很小，测量误差等导致结果具有高度的不确定性，较适用于农业或草地生态系统。目前，关于葛属植物-根瘤菌共生固氮作用的研究基本处于空白，课题组前期通过15N 自然丰度法粗略比较了喀斯特区域多种豆科植物（野葛、深紫木蓝、香合欢、中南鱼藤等）的共生固氮效率，结果发现野葛-根瘤菌共生体的固氮效率高于深紫木蓝、香合欢等多种植物，仅次于中南鱼藤-根瘤菌共生体[20]。考虑到野葛须根系特别发达，结瘤数量巨大，因此野葛-根瘤菌共生体的固氮总量极其可观，其对于退化土壤的修复具有重要意义。今后，需要进一步加强葛属植物-根瘤菌共生固氮效率的定量研究以及影响葛属植物-根瘤菌共生固氮效率的环境因素的研究，以期为充分发挥葛属植物-根瘤菌共生体的固氮作用提供理论依据和科学参考。

4 葛属植物-根瘤菌共生体的生态适应性及应用

大量研究表明，与同一豆科植物共生的根瘤菌在不同生态环境下存在不同的优势菌种，且不同菌株在生物地理分布、共生匹配性和共生固氮效率方面存在差异，这都是根瘤菌长期适应性分化的结果[9,45-47]。根瘤菌能刺激宿主植物产生诱导系统抗性（Induced systemic resistance）和诱导系统耐受性（Induced systemic tolerance）， 改 变 根 系 结 构（Root system architecture）等，从而提高宿主植物对逆境胁迫的耐受性[48]。葛属植物作为荒坡上常见的先锋植物，其与根瘤菌形成的共生体能够适应多种生态环境。前期研究从野葛根瘤中分离出具有较强耐酸能力的根瘤菌，能够在pH 值=4.6 的强酸环境中生长，酸胁迫显著降低葛藤根系活性和根毛变形率，接种根瘤菌后能显著提高盆栽条件下植株生物量、根瘤鲜重以及植株全氮含量，也能提高根系土壤中微生物数量和土壤酶活 性[49-50]。这表明野葛根瘤菌能在一定程度上协助植物抵抗酸性胁迫，且能影响根际微生物群落，从而提高土壤肥力。另外，葛藤具有一定的富集重金属Cu 的能力，能在铅锌矿废渣场地上生长，是一种适合重金属尾矿和工业污染区的生态经济型建群植物[51-52]。目前，葛属植物根瘤菌在缓解酸胁迫方面有较好的应用效果，今后可进一步开展葛藤根瘤菌对其他逆境胁迫（如重金属胁迫）的响应及适应机制的研究。

根际微生物群落在根瘤菌与宿主互作和共生关系形成中发挥着关键作用[53-54]。已有的研究表明，根瘤菌与其他根际细菌存在明显互作关系，假单胞菌和芽孢杆菌等大豆根际微生物与根瘤中快生、慢生根瘤菌的定殖密切相关[55-57]。因此，在筛选和应用葛属植物根瘤菌资源时，应充分考虑土著根瘤菌及根际微生物群落与接种根瘤菌之间的相互作用。

5 展 望

目前，学者们对大豆及其他栽培豆科作物的根瘤菌开展了大量的研究和应用，但对与野生豆科植物共生的根瘤菌的研究相对较少，关于根瘤菌耐逆境胁迫的分子遗传机制知之甚少。葛属植物作为广泛分布于我国各地的藤本植物，蕴藏着丰富的根瘤菌资源，加强对葛属根瘤菌的研究，对于丰富我国根瘤菌种质资源库、开发根瘤菌菌剂应用于栽培葛的种植和生产中具有重要意义。基于现有的研究，提出以下展望。

（1）系统开展葛属植物根瘤菌资源的调查及分类地位的研究，收集、筛选和保藏一批与葛属植物共生的根瘤菌资源，尤其应加强栽培葛主产区根瘤菌资源的筛选。在此基础上，加强不同生态区（地理环境、土壤类型等因素）葛属植物-根瘤菌遗传多样性以及共生固氮效率的比较研究，明确影响葛属植物-根瘤菌共生体固氮效率的主要因素，揭示葛属植物-根瘤菌共生体的生物地理学分布格局及形成机制。

（2）加强葛属植物-根瘤菌的共生特异性及其与土著根瘤菌竞争作用的研究，并开展葛属植物-根瘤菌共生体对多种逆境的响应机制和分子遗传机制的研究。在此基础上，采用生物技术手段改造或构建优良根瘤菌菌株，开发根瘤菌生物肥料应用于农业生产。