牛丽娜,刘云霄,窦 婧,张 冰,隆 强,徐 强,王晓忠
(1.新疆医科大学第四临床医学院,新疆 乌鲁木齐 830000;2.新疆维吾尔自治区中医医院,新疆 乌鲁木齐 830000)
自噬是一种进化保守的细胞生理过程,在细胞缺氧、缺乏生长因子等应激条件下,细胞自噬活性可被显著诱导,从而导致细胞内容物降解,是细胞生长、存活及自我平衡的重要过程。多种慢性肝病时,持续的炎症坏死导致机体出现修复反应,过量的纤维增生及纤维降解不足致使肝内弥漫性的细胞外基质(ECM)沉积,最终形成肝纤维化[1-3]。若肝纤维化未能给予有效的病因治疗则会发展为肝硬化,甚至肝癌。肝纤维化在世界范围内具有高发病率和高死亡率,据统计,每年有120 万人死于肝纤维化导致的终末期肝病,故怎样使肝纤维化得到逆转是当今肝病领域研究的主要热点之一[4]。近年来,细胞自噬在肝纤维化中的发生机制逐渐被认识,并为治疗肝纤维化提供了新的策略。中医认为肝纤维化是由于肝病日久,机体正虚而无力抗邪,邪毒内侵,造成人体气机不畅,瘀血痰浊等病理产物阻滞于内,进而发为此病。许多中药复方多被报道具有调控细胞自噬改善肝纤维化的作用。本文主要阐述细胞自噬对肝纤维化的影响中医药调控细胞自噬抗肝纤维化治疗进展。
依据自噬导致的降解内容物到达溶酶体的途径,自噬可以分为:巨自噬、微自噬、分子伴侣介导的自噬。
在巨自噬中,膜结构将胞质内的可溶性物质和细胞器包裹形成囊泡结构,囊泡结构不断伸展变为自噬囊泡,自噬囊泡形成膜结构完整的自噬小体。随后自噬小体与溶酶体结合形成将胞质内成分隔离的自噬溶酶体;最后胞质内的成分及自噬小体的膜结构在溶酶体中得到降解,降解后的大分子物质产生可以利用的氨基酸、脂肪酸等。巨噬依赖于自噬相关基因(ATG)蛋白和Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶(VPS34)与Beclin 1(酵母Atg6 的同系物)和ATG14L 复合物的活性,以产生形成自噬体所需的磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3P)[5,6]。自噬体成熟为自溶酶体还依赖于某些ATG 蛋白,如ATG14L 的活性,系聚因子(HOPS 复合物)和接头(PLEKHM1)来执行膜融合过程。巨自噬(以下简称自噬)是本综述主要讨论的一种自噬形式[7]。
微自噬在肝脏中最先被发现,它的主要途径是溶酶体膜内陷,包绕即将要降解的内容物在溶酶体中形成小泡,最后发生降解。微自噬是直接将细胞质内的错误折叠的蛋白或细胞器定位于溶酶体内后分解代谢的过程[8]。目前,肝细胞以及肝星状细胞(HSC)发生微自噬的分子机制研究并不明确。
分子伴侣介导的自噬是一种选择性的自噬过程,目前仅在哺乳动物细胞中被发现。这种自噬方式只降解胞质中的含有KFERQ 基序的可溶性蛋白。在分子伴侣介导的自噬中,胞质中的分子伴侣热休克同源蛋白首先识别底物蛋白并结合;随后变为折叠形式的蛋白被运输到溶酶体与溶酶体相关膜蛋白2A(LAMP2A)结合后底物蛋白去折叠,这时进行膜转位并进入到溶酶体最后被降解。近年来,分子伴侣介导的自噬在代谢调节、抗原提呈以及衰老中被广泛研究[10]。
自噬主要是ATG1 类似物(ULK1)、视网膜母细胞瘤RB1-诱导卷曲蛋白(RB1CC1)以及ATG13形成的复合物与雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)相互作用的结果。当机体能量充足时,mTORC1 活化通过ULK1 及ATG13 的磷酸化对细胞自噬具有抑制作用;当机体能量匮乏时,mTORC1 活性被抑制,ULK1 及ATG13 结合形成复合物与RB1CC1 相互作用诱导自噬[5,7,8,11]。但自噬囊泡的伸展需要泛素化复合系统:ATG12 的结合过程与微管相关蛋白1 轻链3(LC3)的修饰过程;LC3 前体形成后,被ATG4 加工成胞质可溶性的LC3-1,自噬发生时,LC3-I 转变为LC3-II,LC3-II 的数量与自噬泡的数量成正比[12]。
肝细胞是肝脏主要的组成部分,在肝细胞中自噬通过消除错误折叠的蛋白质、脂质过度积累(脂解)和/或线粒体受损(线粒体自噬)来保证肝细胞的能量供应,维持肝细胞内的稳态。研究发现肝细胞自噬能够减少肝脏炎症来达到抑制肝纤维化的效果[13]。肌成纤维细胞的不断产生和激活是肝纤维化发生的关键因素,肝细胞是肌成纤维细胞的重要来源。任何原因的肝损伤均可导致肝细胞通过上皮间充质转化途径转化为肌成纤维细胞,并参与胶原的形成和沉积形成肝纤维化[14]。自噬参与了上皮间充质转化的调控,肝细胞在饥饿或自身消除受损细胞器和错误折叠的蛋白质时,自噬水平会迅速增强。有研究表明,减轻肝纤维化可以通过增强自噬来减弱肝细胞通过上皮间充质转化途径转化为肌成纤维细胞[15]。自噬的增强还可使肝细胞内的ATZ 蛋白发生降解,减轻缺乏α1-抗胰蛋白酶的小鼠肝组织纤维化。故肝细胞自噬被视为对肝脏具有保护作用,通过增强肝细胞自噬可以达到抗肝纤维化的效果[16]。
HSC 的活化是肝纤维化形成的关键因素。肝细胞损伤后引发的炎症反应以及HSC 被激活是形成肝纤维化的起始过程。虽然肝细胞自噬可以起到抗炎及保护肝脏的作用,但是在HSC 中,自噬可以为激活HSC、并为其分化、分泌ECM 提供能量。在肝纤维化发生过程中,HSC 被TGF-β、STAT、核转录因子-κB(NF-κB)等信号通路激活后,自噬通量在HSC 中增加。在一项研究中发现:随着小鼠的HSC 活化水平的增加,自噬标志物LC3-II 的表达以及自噬泡的数量也随之增加[15]。有研究提出了自噬促进静止的HSC 中脂滴分解,从而促进了HSC活化[17]。除了脂解外,自噬底物p62 的下调可能是HSC 活化的另一种机制,p62 通过与自噬体膜上LC3 结合的LIR 结构域利用自噬不断降解。一项研究表明HSC 中p62 缺乏的小鼠比对照组小鼠更容易发生肝纤维化[18]。由此可见,抑制HSC 自噬是预防和缓解肝纤维化潜在的治疗策略。
肝脏巨噬细胞在肝纤维化发生、发展过程中具有调控作用。肝脏巨噬细胞的自噬可通过抑制促炎因子分泌以保护肝组织。研究发现当自噬相关蛋白如ATG5、Beclin-1 等缺失时,肝脏巨噬细胞分泌促炎因子IL-1β。一项使用ATG5 基因特异性敲除的小鼠的研究中发现:小鼠肝组织中促炎因子IL-1β、IL-1α 表达显著增强,该结果也提示巨噬细胞自噬可以减轻炎症反应以抑制肝纤维化的发生[18]。
基于细胞自噬在不同的细胞类型中作用的差异,我们可以了解到细胞自噬在肝纤维化发生、发展中具有不同的意义[19]。一方面,肝细胞、肝脏巨噬细胞发生自噬可以减轻肝脏炎症反应发挥保护肝组织的作用;另一方面,HSC 自噬可以为激活HSC 提供能量从而促进肝纤维化的发生、发展。
AMPK 信号通路是诱导细胞发生自噬、促进肝纤维化最为经典的通路之一。AMPK 可促进HSC活化,并且在肝纤维化的组织中表达水平增高。在缺乏营养、长时间运动等应激条件下AMPK 通路可被激活。研究发现AMPK 还可以在2 型糖尿病药物的作用下被激活,如二甲双胍。一些天然存在的化合物,包括白藜芦醇,已被证明可以激活AMPK[20,26]。AMPK 调节细胞生长是通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶点复合物1 (mTORC1)途径实现的。 mTORC1 还可以参与自噬的调节,mTORC1 可抑制自噬相关蛋白ATG1 的活性。一项动物实验研究发现[21],缺乏AMPK 的肝细胞和小鼠胚胎成纤维细胞有线粒体自噬缺陷以及p62 表达水平升高。另一项研究证明了经过脂多糖处理后,小鼠HSC 中自噬体形成和自噬通量的显着增加是通过AMPK-ULK1 途径介导的[22]。
PI3K/Akt/mTOR 信号通路是mTOR 所介导调控自噬最主要的途径之一。mTOR 包含两种复合物:mTORC1 及mTORC2,其中mTORC1 为介导HSC 自噬的主要因子,对细胞自噬的过程具有负向调节的作用[19,28]。mTOR 被PI3K/Akt 信号通路激活后, 继而mTORC1 通过Akt-TSC1/2-RheBm-TORC1 途径被激活,从而减少自噬通量抑制自噬发生。有研究指出采用PI3K 的抑制剂LY294002处理HSC-T6 后,细胞内LC3Ⅱ的表达水平升高,表现为自噬水平增强,与此同时,HSC-T6 中Akt、mTOR 表达水平也显著降低,表明抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路可提高HSC-T6 自噬水平[27]。
肝细胞在肝纤维化过程中通过上皮-间充质转化转化为肌成纤维细胞,Kong 等[28]研究发现姜黄素通过抑制肝细胞中的活性氧以及氧化应激水平,并调节自噬相关途径AMPK 和PI3K/Akt/mTOR 的上游信号通路,导致肝细胞中自噬通量增加。并证实姜黄素通过诱导肝细胞自噬显著减少肝细胞中的上皮-间充质转化为肌成纤维细胞,有效控制了肝纤维化进展。
核转录因子NF-κB 广泛分布于各种细胞中,参与调控多种生理、病理过程。NF-κB 信号通路通过参与调控炎症反应,在HSC 激活、分化过程中发挥了重要作用[28]。该信号通路在诱导细胞自噬的过程中具有重要作用:NF-κB 信号通路参与调控多个自噬相关基因,如Beclin-1 和LC3-Ⅱ[29]。当NF-κB通过IκB 激酶的磷酸化被PI3K/Akt 信号通路激活后,其诱导自噬相关基因表达水平增加,导致自噬的发生。这也为临床治疗肝纤维化提供了新的策略:近年来,通过调控NF-κB 信号通路治疗肝纤维化的机制逐渐被认识:Bai F 等研究发现金莲花碱(马齿苋酰胺E)可通过抑制NF-κB 通路来调控自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、P62、ATG5、ATG7 的表达,进而显著抑制了HSC-T6 自噬,阻止了HSC 的活化[30]。Yu 等[31]从中药延胡索中提取的一种有效成分左旋延胡索乙素,并发现左旋延胡索乙素可通过调节PPARγ/ NF-κB 信号通路抑制HSC 的活化和自噬,发挥其抗纤维化作用。
阴阳调和是指阴阳自动维持和自动恢复的能力和趋势,阴阳二气在生理状态下的协调以及病理状态下自我平衡是生命活动的基础。中医认为自噬是一种调节机体阴阳,使阴阳保持平衡的一种机制,其降解代谢产物属阴,提供能量属阳,二者协调共同维持细胞内稳态,即“阴平阳秘,精神乃治”[29,30]。当细胞在缺氧、缺乏生长因子、饥饿等应激条件下,细胞自噬就会被激活,错误折叠的蛋白以及受损的细胞器被降解,转化为生命活动所需的能量物质,促进微环境的平衡。阴阳相互制约,《素问·阴阳应象大论》提出:阴盛则阳病,阳胜则阴病。如果降解代谢或提供能量一方过于强势,就会制约另一方,导致制约太过;如果一方过于虚弱,对另一方的制约不及,就会导致细胞过度消化致使细胞死亡。正常的细胞死亡会致使细胞功能丧失而引发疾病。如HSC 过度自噬会为其激活、分泌ECM 提供能量,最终导致肝纤维化[1,7,9,31]。
中医尚无肝纤维化的病名,根据其临床特征,多属于“积聚”、“胁痛”、“黄疸”等范畴。肝纤维化的病因病机复杂, 临床证候较多[32]。中医认为肝纤维化是由于慢性肝病日久,机体正虚,邪毒内侵或情志失调, 致使肝脏损伤, 肝失疏泄, 气血运行不畅;肝病传脾,脾失运化,水湿内阻;肝肾同源, 肝藏血功能受损, 肝脉瘀滞, 肾不主水, 脾不运化水湿, 水液运行不畅, 凝湿成痰, 脉道阻滞, 气血瘀滞, 痰瘀一结而形成本病。或长期饮酒,内生湿热, 湿热凝而化痰, 阻滞气血津液, 瘀血痰浊等病理产物阻滞于内,进而发为此病。该病主要的病理产物是湿、热、毒、浊[29-32]。
多种致病因素致使肝、脾、肾的功能失调而导致痰瘀互结, 为肝纤维化的主要病机。其本质为“虚损生积”。“虚损”在现代医学中,主要体现在肝实质细胞数量的减少和肝脏功能衰退;“生积”主要体现为ECM 的沉积及肝窦毛细血管化。“虚损为本,血瘀致积为标”,肝纤维化病变的不同阶段、不同体质可表现为不同的证型[3]。常见有气阴虚损证、瘀血阻络证、肝胆湿热证、肝郁脾虚证、肝肾阴虚证。近年来,一些经典中药复方如扶正化瘀胶囊、复方鳖甲软肝片、安络化纤丸等对治疗肝纤维化取得显著效果。
祖国医学常采用滋养肝阴、逐瘀祛痰、补益脾气、清热解毒等方法,通过调控细胞自噬来缓解肝纤维化。虽然肝纤维化的发生机制的研究已获得很大进展,但临床目前仍然缺乏有效的抗肝纤维化策略。中医尚无肝纤维化的病名,根据肝纤维化的临床特征,多属于“积聚”、“胁痛”等的范畴[34]。数十年的研究证实,中医药治疗肝纤维化的效果突出,可提高肝纤维化的逆转率[35,36]。
近年来,许多研究表明中药复方具有调控细胞自噬改善肝纤维化的作用。南月敏教授团队自创益气活血方,组方由黄芪、丹参、茯苓、白豆蔻中药组成,通过“益气活血,疏肝健脾”调控肝星状细胞自噬达到抗肝纤维化的目的[37];汪龙德教授以“疏肝化瘀”为法创制的化瘀软肝胶囊,组方包括醋鳖甲、龟板、柴胡、枳壳、丹参、赤芍、炒白术等组成,被证实可下调自噬相关蛋白LC3、Beclin-1 表达水平,并可通过调控PI3K/Akt/mTOR 信号通路起到抗肝纤维化的作用[26];林沛湘教授创制壮肝逐瘀煎由补益药及解毒祛瘀药组成,林沛湘教授团队研究发现该方可抑制NF-κB 的表达以调控自噬改善大鼠肝纤维化[38]。目前中医药治疗肝纤维化最广泛的研究是对基因或信号通路的探讨,还处于基础研究阶段,中医药抗纤维化机制还需要进行更深一步的探索[26-31]。最近一项研究表明,针刺和艾灸可通过调控小鼠肝组织中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1及BNIP3 的表达,增强肝细胞自噬减轻肝损伤。这也为针灸通过调控自噬治疗肝纤维化提供了基础[40]。
自噬是一种程序性细胞死亡方式,是存在于所有有核细胞中的分解代谢过程,主要通过溶酶体降解细胞内的大分子和细胞器,对细胞的生存、分化、生长及内稳态有重要意义。自噬对肝纤维化的意义要取决于不同的细胞类型以及疾病进展的不同阶段,肝细胞自噬可通过减少炎症达到抗肝纤维化的作用;但HSC 自噬通过促进脂滴降解为HSC 激活、分化及分泌ECM 提供能量。故抑制或诱导肝脏中的细胞自噬为抗肝纤维化提供了新的策略。目前研究参与自噬最为透彻的是AMPK 信号通路、PI3K/Akt/mTOR 信号通路以及NF-κB 信号通路。尽管自噬在肝纤维化中的机制研究已经取得较大进展,但对于利用细胞自噬来治疗疾病的机制研究仍需要继续深度研究。中药干预肝纤维化的作用机制主要体现在抑制HSC 活化、调控脂肪细胞因子、减轻肝脏炎性反应、改善氧化应激、抑制肝窦内皮细胞毛细血管化等方面。数十年的研究证明,中医药治疗肝纤维化的效果突出,可提高肝纤维化逆转率,而且许多中药复方多被报道具有调控细胞自噬改善肝纤维化的作用。 挖掘中医的辨证论治与整体观念理论与现代医学相结合治疗纤维化的潜力,发挥中医药治疗肝纤维化优势是未来前进的方向,相信随着研究的不断深入,未来中医药定能为临床抗肝纤维化提供新的策略。
所有作者声明不存在利益冲突关系。