RCN1 和GRP78 在结直肠癌中的表达及临床意义

李灵玉，雷 程，王海江

（新疆医科大学附属肿瘤医院，新疆 乌鲁木齐 830000）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常见的消化系统恶性肿瘤，根据2021 年世界卫生组织国际癌症研究署（IARC）发布的2020 年全球最新癌症统计数据，CRC 世界发病率和死亡率均排前三［1］。在中国，CRC 是第二常见的癌症，癌症死亡的第五大原因。每年发病率和死亡率均占全世界总的三分之一［2］。CRC 治疗主要是以外科手术为中心的多学科治疗模式，使其预后得到了很大改善。然而，我国CRC 发病率和死亡率仍处于较高水平，因此，有必要深入探索CRC 的发生发展机制，为诊断和治疗寻找新的生物标志物。

内质网钙离子结合蛋白1（reticulocalbin-1，RCN1）是 CREC（Cab45/Reticulocalbin/ERC-55/CALU）蛋白家族中的一员，位于人类基因组的11p13 区域，翻译成331 个氨基酸前体，是一种高度保守的钙离子结合蛋白质，定位于内质网（ER），含有6 个钙结合基序、一个HDEL 序列以及内质网高保留信号［3］。RCN1 在肝癌、肺癌、肾癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌、口腔鳞状细胞癌等多种肿瘤组织中的高表达已被证实，并与肿瘤预后密切相关［4-9］。结肠癌中RCN1 在基因和蛋白水平也呈高表达，但其分子机制及预后价值还尚未阐明［10，11］。多项研究表明，RCN1 功能与ER 应激及内质网未折叠蛋白反应（UPR）密切相关。而葡萄糖蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）是UPR 的关键调节蛋白，也称作BIP，由热休克蛋白70（heat shock protein，Hsp70）家族成员HSPA5编码，位于真核生物的ER膜上，是UPR 的关键效应蛋白。UPR 是调节蛋白质稳态的适应性反应，由三个传感器（IRE1、ATF6和PERK）构成，它们都具有结合GRP78 的管腔结构域。在正常条件下为无活性状态，当细胞处于应激时，累积的未折叠蛋白质的存在导致三种传感器与GRP78 解离，形成反馈控制调节细胞凋亡，并使得GRP78 的表达增加［12］。

因此，本研究通过TCGA 数据库及临床样本验证的方法，分析RCN1 和GRP78 的表达与CRC 临床病理特点的相关性及预后价值，验证两者在CRC中的表达相关性。

1 材料与方法

1.1 从TCGA、UALCAN 和GSCA 在线数据库提取数据

从XENA 下载TCGA 结肠癌（COAD）和直肠癌（READ）患者基因表达数据，验证RCN1 mRNA和HSPA5 mRNA 在CRC 中的表达水平。利用UALCAN 在线数据库探索RCN1 和HSPA5 mRNA 与CRC 临床病理特征的相关性。

1.2 临床资料标本来源

收集2017 年1 月～2022 年8 月在新疆医科大学附属肿瘤医院初治经病理诊断为CRC 且行手术治疗的癌及癌旁石蜡组织标本，共78 例。癌旁组织均距离癌组织至少5 cm 以上的正常结直肠组织。纳入标准：（1）年龄＞18 岁；（2）术后病理诊断分期为Ⅱ～Ⅲ期并接受标准方案奥沙利铂+卡培他滨两药辅助化疗；（3）随访资料完整。排除标准：（4）既往5年内有其他恶性肿瘤病史；（5）存在严重的基础疾病或合并症，可能干扰本研究的评估；（6）合并家族性腺瘤性息肉病或者炎症性肠病。按年龄分组：年龄≤60 岁43 例，＞60 岁35 例。按发病部位：结肠癌38 例，直肠癌40 例。大体类型：隆起性15 例，溃疡型61 例，浸润型2 例。分化程度：低分化30 例，中-高分化48 例。本研究经新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准（批准文号：K-2023044），患者均知情且签署同意书。

1.3 免疫组织化学检测

从标本库调取78 例CRC 癌及癌旁组织，制作成4 μm的切片。脱蜡水化后进行高温修复抗原，经0.3%过氧化氢孵育阻断内源性过氧化物酶的活性，然后加入兔抗人单克隆抗体RCN1（1∶150，abcom）、GRP78（1∶100，proteintech），4 ℃孵育过夜，加入羊抗兔二抗37 ℃温育1 h，DAB 显色及苏木精复染，梯度酒精脱水，封片。

1.4 判定标准

免疫组化结果由两名病理科医师判定，评分包括染色强度和阳性细胞百分比。染色强度评分：无染色计0 分，黄色计1 分，黄褐色计2 分，棕色计3分。阳性细胞百分比评分：≤5%计0 分，6%～25%计1 分，26%～50% 计2 分，51%～75% 计3 分，＞75%计4 分。总分为阳性细胞评分和染色强度评分相乘，评分范围为0～12 分。根据免疫组化评分结果进行分组，其中≤6 分为低表达组，＞6 分为高表达组。

1.5 病例随访

对患者的随访采用病例随访系统查询及电话随访两种方式，随访所有患者的生存状态及生存时间，截止时间为2023 年3 月1 日，无病生存期（disease free survival，DFS）为手术日期至患者疾病复发或随访截止日期。总生存时间（overall survival，OS）为手术日期至患者死亡日期或随访截至日期。随访截止时，未发生死亡或复发根据随访截止时间做后续分析。

1.6 统计分析

在线数据库分析采用数据库默认统计方法，实验及病例资料数据采用SPSS27.0.1 和Graphpad 8处理数据，RCN1、GRP78 的表达情况采用独立样本t检验，临床病理特点分析采用卡方检验，预后分析采用Kaplan-Meier 生存分析、单因素及多因素COX回归分析。相关性分析采用Pearson 相关分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RCN1 和HSPA5 基因在CRC 中的表达及相关性分析

利用TCGA 数据库探究RCN1、HSPA5基因在CRC 的表达情况。如图1 所示，RCN1和HSPA5 在COAD 和READ 组织中的表达水平显著高于正常肠黏膜组织，两者mRNA 表达在COAD 和READ中均呈正相关。

图1 RCN1 和HSPA5 mRNA 在COAD 和READ 中的表达水平及两者表达相关性Fig 1 Expression levels of RCN1 and HSPA5 mRNA in COAD and READ their expression correlation

2.2 UALCAN 分析RCN1、HSPA5 基因表达与CRC 临床病理特征的相关性

如图2 所示，RCN1 mRNA 水平与READ N 分期相关，在N2 中的表达显著高于N1 和N0，HSPA5 mRNA 在结肠黏液腺癌中表达更高。 RCN1 mRNA 与CRCTP53突变相关，TP53突变的CRC中mRNA 的表达显著高于TP53未突变。

图2 通过UALCAN 数据库分析RCN1、HSPA5 mRNA 与CRC 临床病理特征的相关性Fig 2 The association of RCN1 / HSPA5 mRNA with the clinicopathological features of colorectal cancer were analyzed by the UALCAN database

2.3 RCN1 和GRP78 蛋白在CRC 癌及癌旁组织中的表达情况

根据免疫组化结果，RCN1 及GRP78 蛋白在CRC 组织中定位在细胞质（图3）。78 例CRC 组织中RCN1 高表达58 例，占74.4%，低表达20 例，占25.6%，癌旁组织中高表达3 例，占3.8%，低表达75例，占96.2%。RCN1 在癌组织中的表达显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.000 1，图4）。78 例CRC 癌组织中，GRP78 高表达39 例，占50%，低表达39 例，占50%，癌旁组织中高表达1例，占1.2%，低表达77 例，占98.8%。GRP78 在癌组织中的表达显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.000 1，图4）。

图3 免疫组化检测RCN1、GRP78 蛋白表达情况（SP×100）Fig 3 The expression of RCN 1 and GRP 78 protein detected by immunohistochemistry （SP×100）

图4 RCN1 和GRP78 蛋白在结直肠癌及癌旁中的表达水平Fig 4 Expression levels of RCN 1 and GRP78 protein in colorectal and adjacent cancers

2.4 RCN1 和GRP78 的表达与临床病理特征的相关性

分析RCN1 和GRP78 的蛋白表达水平与临床病理特点之间的相关性（表1）。RCN1、GRP78 表达与CRC 患者性别、年龄、肿瘤位置、最大直径、分化程度、N 分期、大体类型以及是否侵犯血管和神经无显著相关性。其中，GRP78 与CRC T 分期显著相关（P=0.011）。

表1 RCN1、GRP78 蛋白表达与CRC 临床病理特征的相关性Tab 1 The correlation between RCN1/GRP78 protein expression and clinicopathological features of colorectal cancer

2.5 RCN1 和GRP78 与CRC 患者预后的相关性

78 例结肠癌患者中，术后复发39 例，未复发39例，死亡13 例，其余65 例末次随访时间时仍存活。采用K-M 生存曲线分析，RCN1 高表达与CRC 患者较短的DFS 显著相关（P＜0.01），高表达RCN1 患者的OS 比低表达RCN1 的患者有更短的趋势，无统计学差异（图5）。

图5 RCN1 蛋白高表达组和低表达组的生存预后情况Fig 5 Survival rate of groups with high and low RCN 1 protein expression

单因素COX 回归分析CRC 的DFS 危险因素，N 分期、TNM 分期、肿瘤侵犯神经和血管、RCN1 高表达是CRC 不良预后的危险因素（表2）。RCN1 高表达组的复发风险是低表达组的3.038 倍（HR=3.038，P=0.014）。

表2 78 例CRC 患者DFS 的COX 单因素分析Tab 2 COX univariate analysis of DFS in 78 colorectal cancer patients

用N 分期、TNM 分期、肿瘤侵犯神经和血管、RCN1 表达进行DFS 多因素COX 回归分析，结果显示肿瘤神经侵犯情况、TNM 分期和RCN1 表达水平是CRC 患者术后复发的独立危险因素（表3）。

表3 78 例CRC 患者DFS 的COX 多因素分析Tab 3 COX multivariate analysis of DFS in 78 colorectal cancer patients

2.6 RCN1 和GRP78 在CRC 中的表达相关性

与生信分析结果一致，相关性分析结果提示，RCN1 和GRP78 在CRC 中的表达呈正相关（r=0.260，P=0.021，表4）

表4 RCN1 和GRP78 蛋白表达相关性Tab 4 Correlation between RCN 1 and GRP 78 protein expression

3 讨论

RCN1 作为内质网驻留蛋白，在发生ER 应激的病理生理条件下促进细胞存活［13］。已有研究发现，RCN1 在多种实体肿瘤中呈高表达，与不良预后显著相关。RCN1 可被核因子kappa B（NF-κB）反式激活，进而通过钙稳态和PERK-CHOP 信号通路抑制内质网应激诱导的细胞凋亡，并且RCN1 的前两个EF-hand 钙结合基序与内质网腔结构域上的肌醇1，4，5-三磷酸（IP3）受体1（IP3R1）特异性相互作用并降低未折叠蛋白反应（UPR）来抑制内质网钙释放和细胞凋亡［14］。结直肠癌中，RCN1 基因水平和蛋白水平均显著上调，但其表达与CRC 患者临床病理特征及预后价值的研究较少［10］。本研究基于TCGA 数据库及UALCAN 在线分析RCN1 基因在CRC 中呈显著高表达，与N 分期、TP53 突变显著相关。进而通过免疫组化在78 例临床标本中验证，RCN1 蛋白在癌组织中的显著高表达。在随后的预后分析中发现，RCN1 高表达与CRC 患者DFS 显著相关，是术后复发的独立危险因素。

GRP78 已被证实在CRC 肿瘤增殖、转移及细胞凋亡抗性机制中发挥关键作用，是潜在的CRC 抗肿瘤药物治疗靶点［15-17］。RCN1 和GRP78 在肿瘤中可以相互作用也有多项研究，在耐药肝癌细胞中，RCN1 的EFh1/2 结构域可以与GRP78 相互作用，促使GRP78 与IRE1α 解离，导致IRE1α 激活，进而通过IRE1α-XBP1s 通路激活索拉非尼耐药细胞中的c-MYC 信号传导，促进肿瘤发展［18］。在前列腺癌研究发现，抑制癌细胞中RCN1 的表达，可观察到caspase-3 的激活和核酶PARP 的裂解，GRP78 表达上调促进内质网应激，导致依赖CaMKII 的通路激活导致细胞死亡［19］。本研究发现，在CRC 中，GRP78 呈显著高表达，临床病理特征分析中与T 分期相关。RCN1 和GRP78 相关性分析结果显示：两者表达呈正相关。提示RCN1 可能通过GRP78 促进CRC 的发展，为揭示CRC 发展的分子机制及潜在治疗靶点提供了新的线索。

综上所述，RCN1 在CRC 中显著高表达，与UPR 关键蛋白GRP78 表达呈正相关，此外，肿瘤神经侵袭、TNM 分期及RCN1 高表达是CRC 不良预后的独立危险因素。本研究数据首次验证RCN1 高表达对RCR 患者的OS 和DFS 产生影响，其潜在的致癌作用可能与GRP78 的表达有关。这对进一步证实RCN1 在CRC 中的确切功能具有重要意义。

作者贡献度说明：

李灵玉、雷程：研究设计和数据分析；李灵玉：文章撰写，实验校对；雷程：论文撰写指导；王海江：全面指导研究，经费资助。

所有作者声明不存在利益冲突关系。