AIF1 在急性髓系白血病中的表达及生物信息学分析

高娅娅，李妙雨，孙文瑞，贾双双，田 彪，肖婉婷，张春燕，冯 娟，高广勋

（1.陕西中医药大学第二临床医学院，陕西 咸阳 712000；2.解放军空军军医大学西京医院血液内科，陕西 西安 710000）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia ，AML） 可由基因突变、染色体易位或分子水平的变化引起，是一种生存具有高度异质性的疾病，预后不一。AML 是成年人中最常见的白血病，约占所有疾病的80%［1］。随着诊疗技术的进展，AML 患者的生存较前有所改善，但老年人群的预后仍然较差［2］。新的生物标志物的发现可能有助于更好地理解AML 的分子基础，并在AML 的诊断、疗效预测、预后判断中发挥重要作用，甚至为未来的靶向药物开发和治疗提供新的靶点。

同种异体移植炎症因子-1（allograft inflammatory factor 1，AIF1）是一种 17 kDa 的钙结合蛋白，由单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞产生，它的合成是由 INF-γ 诱导的［3］。AIF1 基因位于染色体 6p21.3上的主要组织相容性复合体 Ⅲ类区域。既往在多种不同的疾病中观察到 AIF1 表达增加，包括子宫内膜异位症，动脉粥样硬化，类风湿性关节炎和纤维化［4，5］。既往研究报道AIF1 在神经系统退行性疾病和代谢紊乱（如代谢综合征和糖尿病）中促进疾病发生发展的作用［5，6］，在糖尿病肾病中 AIF1 通过miR-34a/ATG4B 通路调节人肾小球内皮细胞的炎症、氧化应激和自噬水平，通过体内体外实验研究发现 AIF1 表达升高时，miR-34a、活性氧和炎症因子水平明显升高，而自噬相关蛋白下降，而 AIF1 基因下调效果相反［7］。也发现 AIF1 参与多种不同的肿瘤疾病中，包括乳腺癌，肝细胞癌，非小细胞肺癌等。在乳腺癌中，AIF1 通过激活 NF-κB/细胞周期蛋白 D1 通路促进乳腺癌增殖，促进肿瘤生长［8］。在肝细胞癌中 AIF1 表达升高与门静脉肿瘤血栓形成显著相关，沉默 AIF1 表达可抑制肝细胞癌细胞增殖和迁移［9］。在结直肠癌中 AIF1 通过激活 p38 MAPK 信号通路抑制结直肠癌细胞增殖和迁移，诱导细胞发生凋亡从而发挥抗肿瘤作用［10］。在非小细胞肺癌中，AIF1 通过激活 p38 MAPK 和 JAK/STAT 信号通路来促进非小细胞肺癌细胞系的增殖、迁移、IL-6 分泌和 VEGF 分泌［11］。非小细胞肺癌中高 AIF1 表达还与转移、较高的 TNM 分期和较差的生存率有关。在血液肿瘤中，课题组通过GEO 骨髓瘤数据集分析发现AIF1 在多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）中低表达，且与MM 进展、治疗反应、ISS 分期及无进展生存期呈负相关。体外细胞水平验证了过表达AIF1 后增加了骨髓瘤H929、U266 细胞的凋亡比例，降低了自噬水平，初步机制探索认为AIF1 可能是通过 PI3K/AKT 通路影响 MM 细胞自噬和凋亡，综上表明 AIF1 可能在MM 发生发展中发挥着重要的作用。

本研究旨在通过数据库挖掘分析确定AIF1 的表达量与AML 预后之间的关系：首先，获得癌症基因组图谱（TCGA）和基因型-组织表达（GTEx）的初治AML 样本RNA-seq 数据，分析核心基因AIF1的差异表达［12］。其次，通过GO、KEGG 对AIF1 进行功能富集和通路富集分析，选择与AIF1 相关的显著改变的基因和通路。最后， 应用GEO 数据库的生存数据集进行Kaplan-Meier 生存曲线绘制、采用Cox 回归和诺莫图预测模型，分析AIF1 在AML中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 RNA-seq 数据和生物信息学分析

通过UCSC Xena （https：//xenabrowser.net/datapages/）网站获得癌症基因组图谱（TCGA）数据库和基因型-组织表达（GTEx）数据库的33 种肿瘤类型和正常组织的RNA-seq 数据及相关临床数据［13］。从TCGA 数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/repository） 获 取 初 治 AML 样 本 的HTSeq-FPKM 和HTSeq-Count 数据进一步分析。本研究实施的所有程序均符合《赫尔辛基宣言》（2013 年修订）。

1.2 人类蛋白质图谱（HPA）数据库分析

HPA（https：//www.proteinatlas.org/）数据库包含蛋白组学、转录组学以及系统生物学数据，可以绘制组织、细胞、器官等图谱，不仅收录了肿瘤组织以及正常组织的蛋白表达情况，还可以绘制肿瘤患者的生存曲线［14］。本研究以“AIF1”为关键词分析了AIF1 在各种细胞系如白血病细胞系、肺细胞系、乳腺细胞系和脑细胞系中的表达。

1.3 差异表达基因（DEGs）分析

使用R 软件中的“limma”包对合并后的数据集进行差异基因分析，以P＜0.05（P：校正P）与|log2FC|＞1.5 为过滤条件筛选DEGs。通过分析不同AIF1 表达组之间的差异表达基因（低表达组：0%～50%； 高表达组：50%～100%），利用pheatmap 包绘制热图，并标注上调与下调最显著的前10个DEGs。

1.4 富集分析

运用R 软件中“clusterProfiler”包，以P＜0.05为过滤条件，对DEGs 进行基因本体 （gene ontology，GO）、京都基因和基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和疾病本体（disease on-tology，DO）富集分析。

1.5 蛋白质互作（PPI）网络

利用Metascape （https：//metascape.org/gp/index.htm）进行通路和过程富集分析。使用STRING数据库预测DEGs 的PPI 网络。用Cytoscape（版本3.9.0）绘制PPI 网络，并使用MCODE（版本1.6.1）识别PPI 网络中最重要的模块。根据PPI 的中心节点及聚类情况，筛选在显著性富集结果中出现的基因为关键基因［15］。

1.6 预后模型生成和预测

使用RMSR 软件（版本6.2.0）生成诺莫图，绘制诺莫图预测概率和观测率。并通过1 000 个自举样本的校准曲线来验证预测模型的准确性，当曲线与45°对角线吻合时，预测概率与实际结果频率一致性较好。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

1.7 分离收集CD34+细胞

收集西京医院血液科20 例初诊AML 患者的骨髓标本，10 例健康受试者的骨髓标本。健康受试者均接受病毒感染和骨髓异常的筛查，这些受试者没有使用过免疫调节药物，也没有已知的影响免疫系统的疾病。采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，CD34+磁珠分选CD34+细胞。冷冻CD34+细胞用于后续实验。

1.8 免疫印迹

根据上述方法收集患者骨髓样本，并收集单个核细胞裂解物。使用RIPA 缓冲液低温下提取蛋白样品，并在4 ℃离心30 min 去除不溶物。电泳分离蛋白质后，PVDF 膜进行蛋白质转移，室温下牛奶封闭 1 h。在 4 ℃ 冰箱中与AIF1 一抗孵育过夜。次日用TBST 洗涤 PVDF 膜，并在室温下与二抗孵育1 h。TBST 去除过量的抗体后使用发光试剂盒进行曝光。选择 GAPDH 作为内参，通过 Image Lab分析蛋白表达量。

1.9 qRT-PCR

用TRIzol 法提取单个核细胞的总RNA。根据mRNA qPCR RT Master Mix 试剂盒合成cDNA，使用SYBRⓇGreen Realtime PCR Master Mix 进行实时荧光定量PCR。以GAPDH 作为内参。AIF1的特异性引物如下：正向，5′-ACGTTCAGCTACCCTGACTTTCT-3′；反向，5′-CCTGTTGGCTTTTCCTTTTCTCT-3′。GAPDH 的特异性引物如下：正向，5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′；反向，5′- GGCTGTTGTCATACT TCTCATGG -3′。

1.10 统计学分析

所有的统计分析都基于R 软件（版本：3.6.3）或者SPSS（版本：23.0）。

2 结果

2.1 AIF1 在泛癌和AML 中的表达

从 UCSC XENA （https：//xenabrowser.net/datapages/）下载TCGA 数据库中肿瘤和GTEx 数据库中正常人的RNA-seq 数据。通过标准化分析，本研究发现AIF1 在25 种肿瘤中存在显著表达差异（图1A），在初治AML 患者样本中表达高于正常组织（图1B）。随后，根据HPA 数据库中RNA-Seq 数据分析AIF1 在初治AML 中的相对表达水平，可发现AIF1 mRNA 在AML 细胞系如HMC-1、NB-4、HEL、THP-1 和U937 中的表达高于淋巴细胞系。同时，AIF1 mRNA 在其他如脑、胰腺、肺等的细胞系中几乎不表达（图1C）。

图1 AIF1 在泛癌和AML 中的表达Fig 1 The expression of AIF1 in AML compared with normal samples

2.2 AIF1 高表达和低表达的AML 样本的DEGs鉴定

分析高、低表达组间基因表达谱mRNA 中位表达量的差异，鉴定出具有统计学意义（|logFC| ＞1.5，P＜0.05） 的DEGs 共1 275 个，其中有444 个上调基因和831 个下调基因（图2A）。AIF1 高表达组差异最显著的前5 个DEGs 和低表达组差异最显著的前5 个DEGs（图2B）。

图2 AIF1 高表达和低表达的AML 样本的DEGs 鉴定Fig 2 Identification of DEGs in AML samples with high and low expression of AIF1

2.3 DEGs 功能富集分析

为探索AML 中AIF1 高表达和低表达之间的DEGs 的功能意义，本研究使用cluster profile 包进行GO 分析和KEGG 通路富集分析（补充表1，图3）。GO 分析结果显示DEGs 与生物过程（BP）相关的功能包括白细胞迁移、细胞外结构组织和细胞外基质组织；与细胞成分（CC）相关的包括含胶原的细胞外基质、神经元胞体和质膜外侧面；与分子功能（MF）相关的包括受体配体活性、细胞外基质结构成分、货物受体活性。KEGG 分析发现DEGs 功能涉及神经活性配体-受体相互作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用和金黄色葡萄球菌感染。

表1 TCGA 数据库AML 样本中AIF1 表达与临床病理特征之间的关系［n（%）］Tab 1 Association between AIF1 expression and clinicopathologic features in AML samples from the TCGA database［n（%）］

图3 TCGA-LAML 患者AIF1 高表达和低表达DEGs 的GO/KEGG 富集分析Fig 3 GO/KEGG enrichment analysis of DEGs between high and low AIF1 expression in TCGA-LAML patients

图4 富集图来自基因集富集分析（GSEA）Fig 4 Enrichment plots from the gene set enrichment analysis （GSEA）

在AIF1 高表达和低表达的数据集之间进行GSEA 分析，以识别参与AML 的关键信号通路。在这些通路的数据库MSigDB 中观察到显著的差异 （FDR＜0.25， 校正P＜0.05）（补充表2 和图4）。在AIF1 高表达组中，AML 中的基因突变或融合基因如CBFB-MYH11 融合、NPM1 突变和MLL 融合显著富集（校正P＜0.05，FDR＜0.05）（图4A～4C）。相反，在AIF1 低表达组中，AML 中预后较好的因子如PML-RARA 融合基因和AML1-ETO 融合基因表现出显著富集（图4D～4F）。AIF1 涉及NFκB、P53 和MAPK 通路参与AML 及其他肿瘤的发生（图4G～4I）。

表2 logistic 回归分析AML 临床病理因素与AIF1 表达的关系Tab 2 The relationship between the clinicopathological factors of AML and AIF1 expression by using logistic analysis

2.4 AML 的PPI 富集分析

通过STRING 构建AIF1 及其相关基因的共表达网络，共筛选出1 275 个DEGs（| logFC | ＞1.5，P＜0.05）并导入PPI 网络。利用Cytoscape-MCODE显示PPI 网络。最显著的模块MCODE 得分为20.267，包含31 个节点和608 条边（图5）。

图5 AIF1 相关DEGs 的PPI 网络Fig 5 The PPI network of AIF1-related DEGs

2.5 AIF1 表达与AML 临床特征的关系

表1 是TCGA 中AML 患者的主要临床特征。共纳入151 例患者，其中男性83 例，女性68 例，平均年龄65.5 岁。其中，AIF1 在75 例（49.7%）AML 患者中低表达，其余76 例（49.3%）患者中高表达。相关性分析提示AIF1 高表达与细胞遗传学风险、FAB 分型、NPM1 突变、白细胞（WBC）计数（×109/L）显著正相关（P＜0.001）。此外，AIF1 表达与总生存期（overall survival ， OS）显著相关（P=0.009），高表达患者生存期则较短。

采用Logistic 回归分析进一步验证AML 患者临床病理因素与AIF1 表达的关系。结果显示AIF1高表达与高WBC 计数（×109/L） （OR=4.264；P＜0.001）、高细胞遗传学风险（OR=7.322；P＜0.001）和NPM1 高突变（OR=6.245；P＜0.001）呈显著正相关（表2）。ROC 曲线分析AIF1 在AML中的潜在诊断价值，AUC 值为0.985，提示AIF1 可能是诊断AML 的潜在生物标志物（图6A）。采用Wilcoxon 秩和检验比较AIF1 在不同临床病理特征患者中的表达情况。结果显示，在RAS 突变阳性、WBC 计数＞20×109/L、非M3 型、细胞遗传学风险为中/差和NPM1 突变阳性的患者中AIF1 显著高表达（图6B～6F），这些临床病理特征多数与不良预后相关。

图6 AIF1 表达与临床特征之间的关系Fig 6 Association between AIF1 expression and clinical features

2.6 AIF1 高表达对不同临床病理状态AML 患者预后的影响

采用Kaplan-Meier 法分析AIF1 表达与AML患者预后的关系。如图7A 所示，AIF1 高表达患者的预后明显差于AIF1 低表达患者（OR=1.86（1.22-2.86）；P=0.004）。Kaplan-Meier 分析显示，在年龄≤60 岁（P=0.035）、年龄＞ 60 岁（P=0.041）、WBC 计数（≤20×109/L）（P＜ 0.001）、骨髓原始细胞 ≥ 20% （P= 0.04）、外周血原始细胞≤70% （P= 0.034）、IDH1 R132 突变阴性（P=0.007） 、R140 突变阴性（P= 0.034） 、R172 突变阴性（P=0.014）的亚组中，AIF1 高表达与不良预后相关（图7B～7I）。

图7 AIF1 高表达与AML 患者较差的OS 相关Fig 7 High expression of AIF1 was associated with poor OS in AML patients

使用单因素Cox 回归来评估OS 的预后影响因素，发现AIF1 高表达（P=0.004）、细胞遗传学风险为差/中等（P＜0.001）、年龄＞60 岁（P＜0.001）均为OS 的预后不良因素（表3）。进一步行多因素Cox 回归分析，仅AIF1 高表达（P=0.019）和年龄＞ 60 岁（P＜0.001）具有统计学意义，表明二者为OS 的独立预后不良因素。

表3 单因素和多因素Cox 回归分析影响AML 患者OS 的因素Tab 3 Univariate and multivariate Cox’s regression analysis of factors associated with OS in AML

2.7 AIF1 在AML 中的预后模型

为了更好地预测AML 患者的预后，基于Cox回归分析，使用RMS R 包构建诺莫图 （图8A）。年龄、细胞遗传学风险和AIF1 表达等3 个预后因素被纳入到预测模型中。同时，利用校准图评价预后模型的预测精度。构建带有校准曲线的预后诺莫图，预测个体1、3、5 年的OS （图8B～D）。

图8 AIF1 在AML 中的预后预测模型Fig 8 A prognostic predictive model of AIF1 in AML

2.8 数据验证

基于GEPIA 数据库分析，本研究发现与正常组相比，AIF1 mRNA 表达在AML 患者中显著增加（P＜ 0.01，|Log2FC| ＞ 1）（图9A）。进一步收集AML患者和健康受试者的骨髓样本，分离CD34+细胞，用于qPCR 和Western blot （图9B、C），显示AIF1 在AML 中的表达水平升高。

图9 数据验证Fig 9 Data validation

3 讨论

AIF1 是一种17 kDa 的胞质钙结合炎症反应支架蛋白，主要在免疫细胞中表达［16］。参与各种炎症性疾病，如类风湿关节炎、结肠炎、自身免疫性疾病的发生发展［17，18］。有研究表明，AIF1 通过激活NF-κB/cyclinD1 通路促进乳腺癌增殖，通过p38 MAPK 信号通路上调TNF-α 促进乳腺癌细胞迁移。在胃癌中，AIF1 调节β-catenin 可作为保护性预后指标［19］。然而，目前对AIF1 在AML 中的表达和预后价值知之甚少。

本研究的核心结果是AIF1 在AML 中高表达，并与高细胞遗传学风险和不良预后相关。GSEA 基因富集分析结果提示，AIF1 低表达与NPM1 突变、PML-RARa 融合、AML-ETO 融合相关，是良好的预后因素。相反，AIF1 高表达与NFκB、P53 和MAPK 通路相关，表明AIF1 是一个潜在的预后生物标志物［5］，而且与AML 的致癌通路相关，可能成为一个有前景的治疗靶点。更重要的是，本研究发现在NPM1 突变的AML 中，AIF1 高表达预示预后不良。NPM1 突变发生于约30%的初诊AML，这是迄今为止在AML 中，发现的最常见的基因异常之一。一般认为孤立的NPM1 突变对AML 有积极的预后作用［20，21］。但约30%～60%的NPM1 突变的AML 患者在5 年内复发，或许与AIF1 表达异质性相关，具体机制尚不明确有待进一步研究。此外，NFκB、p53 和MAPK 通路也被发现与AIF1 的高表达密切相关［22］。NF-κB 在AML 中持续激活，使白血病细胞逃避程序性细胞死亡机制，从而增加细胞增殖［22，23］。本研究发现AIF1 高表达与这些通路相关，可能导致其不良预后。

另外，值得注意的是AIF1 高表达与低生存率相关。多因素Cox 回归分析显示AIF1 高表达是除年龄（＞60 岁）外的另一个独立不良预后因素。诺莫图预测模型的建立进一步证实了AIF1 表达对预后的预测作用。因此，AIF1 可能是AML 患者新的不良预后因素。将AIF1、细胞遗传学风险和年龄相结合，构建诺莫图模型，获得更准确的预后预测模型。校准图显示AIF1 相关诺莫图的预测值与1 年、3 年、5 年OS 概率的实际观测值一致性较好。据报道，高龄（＞60 岁）、高细胞遗传学风险、高WBC 计数（＞20×109/L）、FLT3 突变阳性和NPM1 突变阴性是AML 不良预后的预测因素［24］。通过Cox 回归分析和诺莫图模型，发现AIF1 的预测能力可能优于细胞遗传学风险、高WBC 计数、FLT3 突变状态。从这个角度来看，本研究模型可能为个体AML 患者提供个性化评分。

综上所述，本研究首次揭示了AIF1 在AML 中高表达，不仅是AML 预后不良的潜在生物标志物，且可能通过调节免疫细胞的肿瘤侵袭在 AIF1 微环境中发挥重要作用，提示AIF1 可作为调节抗肿瘤免疫应答的治疗靶点。本研究也有一定局限性。首先，由于回溯性特征，研究可能导致选择偏差，未来可进行前瞻性研究以验证生物标志物在AML 个性化管理中的临床应用。其次，未进一步证实AIF1在肿瘤中作用的相关通路。再次AIF1 治疗肿瘤免疫的基础机制和免疫特征的预后价值应进一步研究。

作者贡献度说明：

高娅娅：数据分析及文章写作；李妙雨，孙文瑞，贾双双， 田彪， 肖婉婷，张春燕，冯娟：给予修改意见；高广勋：指导研究设计及文章写作并提供项目基金支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。