花黄色素调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路对冠心病大鼠心肌损伤的影响

包立民 姜焜 王菊 黄方 陈霞

摘要 目的：探讨花黄色素（SY）调控腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/沉默信息调节因子1（SIRT1）/核转录因子-κB（NF-κB）对冠心病（CHD）大鼠心肌损伤的影响。方法：将60只SD大鼠随机分为NC组（生理盐水）、Model组（生理盐水）、SY组（100 mg/kg）、EX-527组（47 mg/kg SIRT1抑制剂）、SY＋EX-527组（100 mg/kg SY＋47 mg/kg EX-527），每组12只，持续4周给予相应药物。试剂盒检测血清三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平和心肌白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）水平；苏木素-伊红（HE）染色法进行心肌组织病理学观察；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法检测心肌细胞凋亡情况；蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测心肌组织AMPK/SIRT1/NF-κB通路相关蛋白表达。结果：与NC组相比，Model组大鼠心肌细胞数量少且排列杂乱，细胞核皱缩，TC、TG、LDL-C、氧化修饰低密度脂蛋白（ox-LDL）、IL-6、TNF-α水平、心肌细胞凋亡率及NF-κB蛋白水平明显上升（P＜0.05），SOD、GSH-PX水平及磷酸化-AMPK（p-AMPK）/AMPK、SIRT1蛋白水平明显下降（P＜0.05）。与Model组比较，SY组大鼠心肌细胞数量增多且排列整齐有序，TC、TG、LDL-C、ox-LDL、IL-6、TNF-α水平、心肌细胞凋亡率及NF-κB蛋白水平明显下降（P＜0.05），SOD、GSH-PX水平及p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明显上升（P＜0.05）；而EX-527组以上指标呈现相反趋势。与SY组相比，SY＋EX-527组大鼠心肌损伤加重，TC、TG、LDL-C、ox-LDL、IL-6、TNF-α水平、心肌细胞凋亡率及NF-κB蛋白水平明显上升（P＜0.05），SOD、GSH-PX水平及p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明显下降（P＜0.05）。结论：SY可能通过调控AMPK/SIRT1/NF-κB通路降低氧化应激，减轻炎症反应，对冠心病大鼠心肌损伤起到一定改善作用。

关键词 冠心病；花黄色素；腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子1/核转录因子-κB通路；氧化应激；心肌

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.0

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一种心血管疾病，其患病率和死亡率极高，因冠心病死亡的人数占全球死亡人数的近三分之一［1］。因此，制定冠心病的预防和治疗策略具有重要意义。冠心病通常由动脉粥样硬化病变造成血管管腔狭窄或阻塞所致，可引起心肌缺血、缺氧或坏死等损伤［2］。花黄色素（safflower yellow，SY）是红花水溶性提取物的有效成分，主要成分为羟基红花黄，具有抗氧化［3］、抗凝血［4］、抗肥胖［5］和神经保护［6］等作用。研究发现，羟基红花黄能够改善冠心病［7］；香青兰总黄酮可能通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）/核转录因子-κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）信号通路，调节能量代谢，发挥其对心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌保护作用［8］。而关于SY是否可以通过调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路对冠心病大鼠心肌损伤产生影响还不清楚。因此，本研究主要探究SY对冠心病大鼠的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

60只无特定病原体（SPF）级雄性SD大鼠购自凌云博际（北京）科技有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0018。本研究已获得本院动物伦理委员会的批准。

1.2 主要试剂

SY（货号：YT06466）购自北京伊塔生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide Dismutase，SOD）酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒（货号：EK-R36954）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒（货号：EK-R36902）ELISA试剂盒（货号：EK-R36877）购自上海酶研生物科技有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）ELISA试剂盒（货号：CSB-E12146r）购自武汉华美生物工程有限公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（货号：E03596）购自上海瓦兰生物科技有限公司，SIRT1（货号：ab110304）、AMPK（货号：ab32047）、磷酸化-AMPK（p-AMPK）（货号：ab133448）、NF-κB（货号：ab32360）、磷酸化-NF-κB（p-NF-κB）（货号：ab239882）、GAPDH兔多克隆抗体（货号：ab9485）均购自英国Abcam公司。

1.3 冠心病大鼠模型构建及实验分组

参照文献［1］构建冠心病大鼠模型，即通过喂食高脂食物30 d［（蛋黄粉（10%）、胆固醇（2%）、拉多尔（10%）、丙基硫氧嘧啶（0.2%）、胆酸钠（0.5%）、正常饮食（77.3%）］，第31、32 d腹腔注射脑后垂體素（30 U/kg），构建冠心病模型。NC组饲喂正常饮食，且同步腹腔注射生理盐水（30 U/kg），根据心电图判断建模是否成功［9］。将造模成功的48只SD大鼠随机分为Model组、SY组、EX-527组、SY＋EX-527组，每组12只。SY组灌胃100 mg/kg SY［10］并腹腔注射生理盐水；EX-527组灌胃生理盐水并腹腔注射47 mg/kg EX-527［11］；SY＋EX-527组灌胃100 mg/kg SY并腹腔注射47 mg/kg EX-527，CN组和Model组（各12只）灌胃（10 mL/kg）并腹腔注射生理盐水（2 mL/kg），每日1次，持续4周。

1.4 标本采集

最后1次灌胃SY后，采用尾静脉采血法抽取血液，室温静置1 h后经离心机分离血清，置于－20 ℃保存。每组取6只大鼠的心肌组织固定于4%多聚甲醛中，剩余6只大鼠心肌组织储存于－80 ℃。

1.5 血清脂代谢水平检测

取出1.4保存的血清按照ELISA试剂盒说明书检测TG、TC、LDL-C、ox-LDL水平。

1.6 心肌组织炎性因子及氧化应激指标的检测

取1.4冷冻保存的心肌组织，按照ELISA试剂盒说明书检测大鼠心肌组织中SOD、GSH-PX水平以及炎性因子IL-6、TNF-α水平。

1.7 心肌细胞形态观察

取固定后的心肌组织，经常规脱水、浸蜡、包埋、切片、制片等过程，用苏木精和伊红染色后在光学显微镜下进行心肌组织病理变化的观察。

1.8 心肌细胞凋亡情况

取1.7的心肌组织切片，按照TUNEL试剂盒操作过程，TUNEL阳性细胞核用绿色荧光染色，总心肌细胞核用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况，细胞凋亡率为TUNEL阳性细胞/DAPI染色细胞×100%。

1.9 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测AMPK/SIRT1/NF-κB通路相关蛋白表达

取大鼠心肌组织匀浆，用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，将蛋白质进行变性、定量、电泳、转膜，将膜室温封闭3h后分别加入一抗AMPK（1∶1000）、p-AMPK（1∶1000）、SIRT1（1∶2000）、NF-κB（1∶2000）和GAPDH抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜；加入HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶4 000），室温孵育3h，加入ECL试剂显影后。使用Image LabTM软件分析目标蛋白的灰度值。

1.10 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行数据统计分析，数据以平均值±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组间比较采用SNK-q检验。P＜0.05表示统计学差异显著。

2 结 果

2.1 SY对大鼠脂代谢水平的影响

与NC组相比，Model组大鼠TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平明显上升（P＜0.05）；与Model组相比，SY组大鼠TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平明显降低（P＜0.05），EX-527组大鼠TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平明显升高（P＜0.05）；与SY组相比，SY＋EX-527组大鼠TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平明显上升（P＜0.05）。详见表2。

2.2 SY对大鼠心肌炎性因子的影响

与NC组相比，Model组大鼠IL-6和TNF-α水平明显上升（P＜0.05）；与Model组相比，SY组大鼠IL-6和TNF-α水平明显降低（P＜0.05），EX-527组大鼠IL-6和TNF-α水平明显升高（P＜0.05）；与SY组相比，SY＋EX-527组大鼠IL-6和TNF-α水平明显上升（P＜0.05）。详见表3。

2.3 SY对大鼠心肌氧化应激指标的影响

与NC组相比，Model组大鼠SOD和GSH-PX水平明显降低（P＜0.05）；与Model组相比，SY组大鼠SOD和GSH-PX水平明显升高（P＜0.05），EX-527组大鼠SOD和GSH-PX水平明显降低（P＜0.05）；与SY组相比，SY＋EX-527组大鼠SOD和GSH-PX水平明显降低（P＜0.05）。

2.4 SY对大鼠心肌组织形态的影响

NC组大鼠心肌细胞结构正常、排列井然有序，细胞核膜染色清晰；与NC组相比，Model组大鼠心肌组织结构异常，细胞数量减少且排列杂乱，细胞核皱缩；与Model组比较，SY组大鼠心肌细胞结构正常，染色清晰，EX-527组大鼠心肌细胞出现明显的坏死现象；与SY组相比，SY＋EX-527组心肌损伤加重。详见图1。

2.5 SY对大鼠心肌细胞凋亡的影响

与NC组相比，Model组大鼠心肌细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；与Model组相比，SY组大鼠心肌细胞凋亡率明显下降（P＜0.05），EX-527组大鼠心肌细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；与SY组相比，SY＋EX-527组大鼠心肌细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）。详见图2、表5。

2.6 HDN对大鼠心肌组织p-AMPK、AMPK、SIRT1、NF-κB蛋白表达的影响

与NC组相比，Model组大鼠心肌组织p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明显下降（P＜0.05），NF-κB蛋白水平明显升高（P＜0.05）；与Model组相比，SY组大鼠心肌组织p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明显升高（P＜0.05），NF-κB蛋白水平明显下降（P＜0.05），EX-527组大鼠心肌组织p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明显下降（P＜0.05），NF-κB蛋白水平明显升高（P＜0.05）；与SY组相比，SY＋EX-527组大鼠心肌组织p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明显下降（P＜0.05），NF-κB蛋白水平明显升高（P＜0.05）。详见表6、图3。

3 讨 论

动脉粥样硬化是外周血管疾病发生的主要原因，斑块使冠状动脉管腔狭窄，引发偶发性或持续性心绞痛；一旦破裂，血栓阻塞血流，导致心肌梗死甚至死亡［12］。因此，防治冠心病是临床目前急需解决的问题之一。动脉粥样硬化主要特征是高脂血症和炎症，且动脉斑块主要由脂质细胞、钙细胞和炎症细胞组成［12］。LDL-C是血清脂质中最重要的标准［13］，LDL-C在冠心病的发生和进展中起重要作用［14］。氧化应激和活性氧在动脉粥样硬化的发展中起重要作用，可促进LDL转变为ox-LDL。ox-LDL被巨噬细胞清除受体吸收，导致动脉粥样硬化［15］。本研究通过高脂饮食构建冠心病大鼠模型，结果显示，与NC组相比，Model组大鼠SOD、GSH-PX水平明显下降，TC、TG、LDL-C、ox-LDL水平明显升高，心肌细胞数量减少，且细胞核皱缩，细胞排列杂乱，表明冠心病模型构建成功，Model组大鼠存在高脂血症且抗氧化水平有限。而SY干预可有效降低冠心病大鼠脂質水平，并提高其抗氧化水平，这可能是其改善冠心病大鼠心肌损伤的机制。炎性因子可促进冠状动脉病变的形成，还可促进内膜的增殖并诱导平滑肌细胞向内膜增殖、迁移，加重病变［16］。细胞凋亡对冠状动脉疾病的病理状况也起着至关重要的作用；抑制心肌细胞凋亡可以对冠心病大鼠起到一定的保护作用［17］。本实验结果显示，与NC组相比，Model组大鼠IL-6、TNF-α水平及心肌细胞凋亡率明显升高，与以往研究一致。研究发现SY可以通过减轻炎症反应大鼠改善心肌缺血再灌注损伤［18］。本研究发现，与Model组比较，SY组大鼠心肌细胞数量增多且排列整齐有序，结构完整，IL-6、TNF-α水平以及心肌细胞凋亡率明显下降，提示SY还可通过减轻炎症反应，抑制细胞凋亡来缓解冠心病大鼠心肌损伤。

能量代谢是心肌细胞参与各种活动的基础，AMPK和SIRTI在调节细胞代谢和氧化应激损伤中起着至关重要的作用［19］；通过激活AMPK/SIRTl通路可减轻氧化应激及线粒体凋亡，从而改善脑血管内皮细胞损伤［20］。郭伟伟等［21］研究发现激活AMPK通路能改善冠心病大鼠心肌损伤。本研究发现，与NC组相比，Model组大鼠NF-κB水平明显上升，p-AMPK/AMPK和SIRT1水平明显下降，而SY干预后NF-κB水平明显下降，p-AMPK/AMPK和SIRT1水平明显上升，推测SY可能通过调控AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路，抑制冠心病大鼠心肌细胞损伤。为了验证该推测，本研究利用AMPK/SIRT1/NF-κB通路抑制剂EX-527干预发现，与SY组相比，SY＋EX-527组大鼠心肌损伤加重，TC、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α水平、心肌细胞凋亡率及NF-κB蛋白水平明显上升，SOD、GSH-PX水平、p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明显下降，表明EX-527可减弱SY对冠心病大鼠心肌损伤的保护作用。证实了EX-527可能通过调节AMPK/SIRT1/NF-κB通路对冠心病大鼠起到一定保护作用。另有研究发现，红花黄色素还可以通过抑制MALAT1/NLRP3信号通路减轻肺栓塞大鼠相关心脏损伤［10］，提示SY还可能通过抑制其他通路改善冠心病大鼠心脏损伤，有待进一步研究。

综上所述，SY可能通过调节AMPK/SIRT1/NF-κB通路，提高冠心病大鼠心肌的抗氧化水平，减轻其炎症反应，从而改善心肌损伤。然而，SY调控冠心病大鼠可能涉及其他通路，有待后续进一步探究。

参考文献：

［1］ TU S，XIAO F，MIN X Y，et al.Catechin attenuates coronary heart disease in a rat model by inhibiting inflammation［J］.Cardiovascular Toxicology，2018，18（5）：393-399.

［2］ LIU J W，LIU H T，CHEN L.The therapeutic role of Slit2 in anti-fibrosis，anti-inflammation and anti-oxidative stress in rats with coronary heart disease［J］.Cardiovascular Toxicology，2021，21（12）：973-983.

［3］ LU Q Y，MA J Q，DUAN Y Y，et al.Carthamin yellow protects the heart against ischemia/reperfusion injury with reduced reactive oxygen species release and inflammatory response［J］.Journal of Cardiovascular Pharmacology，2019，74（3）：228-234.

［4］ DENG Z W，CHEN J，LIN B C，et al.A novel 3D printed bioactive scaffolds with enhanced osteogenic inspired by ancient Chinese medicine HYSA for bone repair［J］.Experimental Cell Research，2020，394（2）：112139.

［5］ YAN K M，WANG X Q，ZHU H J，et al.Safflower yellow improves insulin sensitivity in high-fat diet-induced obese mice by promoting peroxisome proliferator-activated receptor-γ2 expression in subcutaneous adipose tissue［J］.Journal of Diabetes Investigation，2020，11（6）：1457-1469.

［6］ PANG J，HOU J W，ZHOU Z，et al.Safflower yellow improves synaptic plasticity in APP/PS1 mice by regulating microglia activation phenotypes and BDNF/TrkB/ERK signaling pathway［J］.Neuromolecular Medicine，2020，22（3）：341-358.

［7］ ZHOU D Y，QU Z J，WANG H，et al.The effect of hydroxy safflower yellow A on coronary heart disease through Bcl-2/Bax and PPAR-Γ［J］.Experimental and Therapeutic Medicine，2018，15（1）：520-526.

［8］ 趙云丽，袁勇，马晓莉，等.基于AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路研究香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护机制［J］.中国药房，2021，32（3）：278-283.

［9］ 李立新，郑妍，张梦娣.芎归汤结合跑台运动对大鼠冠心病治疗作用［J］.基因组学与应用生物学，2020，39（7）：3370-3376.

［10］ 李振国，曲红梅，吴杰.红花黄色素抑制MALAT1信号介导炎症小体活化减轻肺栓塞大鼠相关心脏损伤的研究［J］.临床和实验医学杂志，2021，20（18）：1928-1932.

［11］ ZHAO T，LI Y Q，LIU B L，et al.Histone deacetylase III as a potential therapeutic target for the treatment of lethal sepsis［J］.The Journal of Trauma and Acute Care Surgery，2014，77（6）：913-919.

［12］ LI H，SUN K，ZHAO R，et al.Inflammatory biomarkers of coronary heart disease［J］.Front Biosci（Schol Ed），2018，10（1）：185-196.

［13］ NAVARESE E P，ROBINSON J G，KOWALEWSKI M，et al.Association between baseline LDL-C level and total and cardiovascular mortality after LDL-C lowering：a systematic review and meta-analysis［J］.JAMA，2018，319（15）：1566-1579.

［14］ MUSCELLA A，STEFNO E，MARSIGLIANTE S.The effects of exercise training on lipid metabolism and coronary heart disease［J］.American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，2020，319（1）：H76-H88.

［15］ CHERAGHI M，AHMADVAND H，MALEKI A，et al.Oxidative stress status and liver markers in coronary heart disease［J］.Reports of Biochemistry & Molecular Biology，2019，8（1）：49-55.

［16］ WOLF D，LEY K.Immunity and inflammation in atherosclerosis［J］.Circulation Research，2019，124（2）：315-327.

［17］ GAO G Y，CHEN W W，YAN M J，et al.Rapamycin regulates the balance betweencardiomyocyte apoptosis and autophagy in chronic heart failure by inhibiting mTOR signaling［J］.International Journal of Molecular Medicine，2020，45（1）：195-209.

［18］ 李玲美，付建華，郭浩，等.注射用红花黄色素经TLR-NF-κB炎症通路抗大鼠MIRI的保护作用研究［J］.中国中药杂志，2019，44（12）：2566-2571.

［19］ WANG S M，YE L F，WANG L H.Protective mechanism of Shenmai on myocardial ischemia-reperfusion through the energy metabolism pathway［J］.American Journal of Translational Research，2019，11（7）：4046-4062.

［20］ 张蕴，韩新生，张洪阳，等.N-乙酰半胱氨酸通过AMPK/SIRT1途径抑制缺氧诱导的大鼠脑血管内皮细胞损伤［J］.中国动脉硬化杂志，2020，28（2）：107-112.

［21］ 郭伟伟，张晓鹏，李霞，等.三七皂苷R1调控AMPK/Nrf-2/HO-1信号通路缓解冠心病大鼠心肌损伤的研究［J］.中国现代应用药学，2021，38（1）：36-41.

基金项目 湖北省自然科学基金（No.WJ2018Z0118）

作者单位 1.黄石市第二医院（湖北黄石 435002）；2.湖北文理学院附属医院，襄阳市中心医院（湖北襄阳 441021）

通讯作者 陈霞，E-mail：xyzxcx003851@163.com

引用信息 ［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（7）：-.

（收稿日期：2022-07-14）

（本文编辑王丽）