温阳贴贴敷涌泉穴对慢性心力衰竭病人血清UCP2、外泌体及外泌体内miR-320水平的影响

杨瑞霞 何亚州 郭雨西 唐孝 张安东

基金项目 广西壮族自治区教育厅广西高校中青年教师科研基础能力提升项目（No.2020KY07018）；广西中医药大学校级课题（No.019MS038）

作者单位 广西国际壮医医院（南宁  530201）

通讯作者 何亚州，E-mail：hezhouzhou888@foxmail.com

引用信息 杨瑞霞，何亚州，郭雨西，等.温阳贴贴敷涌泉穴对慢性心力衰竭病人血清UCP2、外泌体及外泌体内miR-320水平的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（7）：1287-1291.

摘要 目的：探讨温阳贴贴敷涌泉穴对慢性心力衰竭（CHF）病人解偶联蛋白-2（UCP2）、血清外泌体及外泌體内miR-320水平的影响，挖掘其作用机制。方法：选取60例CHF病人，随机分为对照组、电针组、穴位贴敷组，每组20例。对照组以西药治疗，电针组、穴位贴敷组分别在西药治疗的基础上加用电针、温阳贴刺激涌泉穴。试剂盒法提取血清外泌体，免疫印迹（Western Blot）法检测CD63、CD81、TSG101、Alix蛋白表达， 纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测径粒大小。使用酶联免疫吸附法（ELISA）检测病人血清中UCP2、氨基末端脑钠肽前体（NT-proBNP）表达水平及外泌体分泌量，实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）检测外泌体内miR-320水平。对NT-proBNP、UCP2、外泌体分泌量、miR-320进行相关性分析。结果：CD63、CD81、TSG101、Alix蛋白阳性表达，NTA径粒分析显示符合外泌体径粒大小。穴位贴敷组NT-proBNP、UCP2、miR-320表达水平高于电针组与对照组（P＜0.05）；穴位贴敷组外泌体分泌量高于电针组与对照组（P＜0.05）。NT-proBNP与UCP2、miR-320呈正相关（P＜0.01），与外泌体分泌量呈负相关（P＜0.01）；UCP2与miR-320呈正相关（P＜0.01），与外泌体分泌量呈负相关（P＜0.01）；外泌体分泌量与miR-320呈负相关（P＜0.01）。结论：温阳贴的治疗CHF的机制可能与外泌体、miR-320的调控以及UCP2介导的心肌能量代谢相关。

关键词 慢性心力衰竭；温阳贴；涌泉穴；解偶联蛋白-2；外泌体；miR-320

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.023

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是临床上多种心血管疾病的最终转归，随着时代的发展、科技的进步，临床中对CHF的治疗手段不断得到丰富，但其居高不下的发病率及再住院率给个人及社会带来了巨大的经济负担，也给病人及家属带来了极大的精神压力，为此迫切需要探寻一种新的治疗模式，以期降低CHF病人发病率，改善病人生活质量［1］。CHF在中医学中属“水肿”“喘证”等范畴，病机多为机体阴阳失调，心阳不振致水饮凌心，痰结、血瘀、水饮为标，素体阳虚为根本，治疗上多予温补心阳、利水养心为法。在现有的治疗模式中，主要有西药结合中药汤剂、针灸、穴位贴敷等治疗方法，其中，穴位贴敷法以其良好的疗效及简便的操作在CHF的中西医结合临床诊疗中占据重要的位置。本课题组前期研究表明，CHF病人miR-320水平明显升高，且这些microRNA主要来源于外泌体中，miR-320水平的上调，加重了心肌纤维化，影响了CHF的发展过程［2］。同时，本课题组通过前期临床观察发现，使用温阳贴贴敷涌泉穴，能有效改善病人症状及心功能情况，但潜在机制尚不明确，故本研究以温阳贴贴敷CHF病人侧涌泉穴，探讨其对CHF病人解偶联蛋白-2（uncoupling protein 2，UCP2）、血清外泌体及外泌体内含miR-320水平的影响，进一步分析温阳贴对CHF的作用及治疗机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料

参照《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》［1］及《慢性心力衰竭中西医结合诊疗专家共识》中的诊断标准，选取2020年6月—12月在我院住院治疗的CHF（阳虚型）病人60例，随机分为对照组、电针组与穴位贴敷组，各20例。本研究经广西国际壮医医院伦理委员会审核批准，同时已详细告知病人本研究的研究目的、方法及相关事项，病人表示同意，并签署临床科研项目受试者知情同意书。

1.2 治疗方法

对照组：依照《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》［1］，在一般治疗基础上，给予CHF常规西药治疗，不使用任何中壮药、中成药、中药针剂等中壮医治疗措施。电针组：在对照组治疗的基础上加用电针刺激双侧涌泉穴。操作如下：病人取仰卧位，常规消毒双足底皮肤后将理疗电极片贴敷于涌泉穴，连接电针仪并调节刺激强度至病人能耐受为度，治疗时间为30 min，每日1次，每周5次。穴位贴敷组：在对照组治疗基础上加用温阳贴贴敷双侧涌泉穴，操作如下：以等量的黄芪、艾草、肉桂药粉以姜汁调和成糊状，取适量摊于无菌敷贴内侧面，常规消毒病人双足底皮肤后，贴敷于病人双侧涌泉穴，每晚睡前敷1次，每次8 h。疗程均为4周。

1.3 实验室指标检测

1）血清样本制备：待各组病人疗程结束后抽取病人静脉血5 mL，4 ℃条件下静置2 h后，3 500 r/min低温离心15 min分离血清，转移至储存管备用。2）试剂盒法提取血清外泌体：取血清3 mL，经0.8 μm针头过滤器过滤除去细胞碎片，转移至新储存管中。使用Qiagen外泌体提取试剂盒提取外泌体，相关操作按说明书进行。 3）外泌体鉴定：使用免疫印迹（Western Blot）法检测外泌体特异性蛋白 CD63、CD81、TSG101、Alix。 提取总蛋白，电泳、转膜，脱脂牛奶封闭120 min，一抗孵育（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。 二 抗（1∶2 000）孵育120 min，TBST洗涤5次，显影、分析。外泌体样本经磷酸缓冲盐溶液（PBS）稀释后使用纳米颗粒追踪分析（NTA）进行径粒分析。4）酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清氨基末端脑钠肽前体（NT-proBNP）、UCP2及外泌体分泌水平：按照试剂盒说明书的方法进行操作。5）实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）检测外泌体内miR-320水平：提取总RNA，逆转录后扩增，miR-320引物序列为GCTGGGTTGAGAGGGCGA，以U6为外参，外参序列为CTCGCTTCGGCAGCACA，应用2－△Ct法计算miR-320的相对表达量，△Ct＝ CtmiR-320－CtmiR-U6。

1.4 主要仪器及试剂

试剂：ExoEasy Maxi Kit（Qiagen，76064）；miRNA提取试剂盒（Qiagen，217004）；

Western Blot一抗：Anti-TSG101、Anti-CD63、Anti-CD81、Anti-Alix（Abcam，ab125011、ab134045、ab155760、ab76608）；Anti-GAPDH（北京中杉金桥，TA-08）；山羊抗兔的二抗（北京博奥森，ZB2301）；UCP2 ELISA试剂盒（北京方程生物科技有限公司）；外泌体ELISA定量试剂盒（EXO-ELIS）；miRcute miRNA isolation Kit（天根生物科技有限公司，DP501）。

儀器：离心机（Centrifuge 5415D，Eppendorf）；生物分光光度计（BioPhotometer，Eppendorf）；荧光定量PCR仪（CFX Connect，TM BIO-RAD）；电泳仪（DYCZ-24DN，北京六一公司生产）；半干转膜仪（WSE-4040、AE6675L，ATTO）；恒温水浴槽（HHS-8金坛医疗）；酶标仪（Thermo，美国）；纳米颗粒跟踪分析仪（ZetaView，德国Particle Metrix）。

1.5 统计学处理

采用SPSS25.0软件进行统计分析。符合正态分布的定量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验，相关性分析采用Pearson分析法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 外泌体鉴定

本研究使用Western Blot分别鉴定了所获样本中外泌体表面的标志性蛋白CD63、CD81、TSG101、Alix，结果均呈阳性。使用NTA径粒分析样本颗粒径粒分布情况，结果显示所获样本颗粒大小在80～200 nm之间，符合外泌体径粒大小。详见图1、图2。

2.2 3组治疗后NT-proBNP、UCP2、外泌体定量、miR-320水平比较

穴位贴敷组治疗后NT-proBNP表达水平低于电针组与对照组（P＜0.05），电针组低于对照组（P＜0.05）。穴位贴敷组治疗后UCP2表达水平低于电针组与对照组（P＜0.05），电针组低于对照组（P＜0.05）。穴位贴敷组治疗后外泌体分泌量高于电针组与对照组（P＜0.05），电针组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。穴位贴敷组治疗后miR-320表达水平低于电针组与对照组（P＜0.05），电针组低于对照组（P＜0.05）。详见表1。

2.3 NT-proBNP、UCP2、外泌体定量、miR-320水平的相关性

NT-proBNP与UCP2、miR-320呈正相关（r＝0.67，P＜0.01；r＝0.70，P＜0.01），与外泌体分泌量呈负相关（r＝－0.61，P＜0.01）；UCP2与miR-320呈正相关（r＝0.40，P＜0.01），与外泌体分泌量呈负相关（r＝－0.37，P＜0.01）；外泌体分泌量与miR-320呈负相关（r＝－0.69，P＜0.01）。详见图3。

3 讨 论

解偶联蛋白（uncoupling protein，UCP）是线粒体内膜上的内膜蛋白，其可以在生物学过程中将氧化及磷酸化进程脱偶联，减少三磷酸腺苷（ATP）的正常生成［3］。研究显示，在哺乳动物中，UCP具有6种亚型（UCP1-6），而UCP2在心脏、肾脏、肝脏及骨骼肌等器官组织中广泛表达［4］。UCP2基因位于人类第11号染色体上，基因长度为8.4 kb，有8个外显子编码309个氨基酸和6个跨膜蛋白，目前已发现其参与机体多种生理及病理过程，UCP2影响心肌细胞中的能量代谢过程可能是调控CHF的潜在作用机制［5］。

心肌细胞中含有大量的线粒体，正常情况下线粒体为心肌细胞提供必须的能量，而当心肌细胞处在病理状态时，大量的线粒体随之发生功能障碍［6］，最终导致心肌能量代谢紊乱。研究证实，当心力衰竭发生时，心肌细胞中ATP含量会明显下降，而UCP2及脂肪酸浓度明显上升［7］，心肌细胞的ATP需求得不到满足成为心力衰竭时心肌细胞能量代谢障碍的中心矛盾。然而，UCP2水平上升使氧化及磷酸化过程脱偶联，降低线粒体膜电位，同时促进无氧糖酵解，继续增加脂肪酸含量，形成恶性循环，进一步使ATP合成减少，甚至发生酸中毒，加重心力衰竭程度［8］，UCP2参与了CHF的发生、发展过程。

miRNAs及外泌体目前已被发现在多种生物学过程中起关键作用，如氧化应激、细胞生成、凋亡、自噬、免疫调控等［9-12］，而其对CHF的调控作用也正逐步被挖掘。研究表明，发生心力衰竭时，机体分泌的外泌体中的miRNAs将会出现差异性表达，而这些差异性表达的miRNA或许会参与疾病的发生及发展过程，如促进心肌纤维化、心脏结构重塑、增强或抑制心肌细胞的凋亡等［13-16］。其中，心肌纤维化是贯穿于CHF发病过程的重要因素，是CHF防治的重要靶点之一。在前期研究中，发现来源于外泌体的miR-320可通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路调控心肌纤维化，且miR-320水平与心肌纤维化严重程度呈正相关，因此，推测miR-320可以通过调控心肌纤维化影响CHF的发生、发展。本研究在西药治疗的基础上加用温阳贴贴敷涌泉穴，观察其对CHF病人NT-proBNP、UPC2、miR-320表达水平及外泌体定量的影响，并分析了各指标之间的相关性，结果表明外泌体分泌量可能与CHF的严重程度呈负相关，结合前期研究，推测在病理状态下，血清中外泌体大量进入细胞内，使心肌细胞中miR-320上调，同时影响UPC2介导的心肌能量代谢过程，从而引起心肌纤维化的发生，进而导致CHF。

心力衰竭歸属于中医学“水肿”“喘证”等范畴，属本虚标实之证，病因以“水”“虚”“瘀”为主，病机多以心阳、心气虚衰，至水饮内停、凌心，治则多以温阳利水、益气活血为法［17］。心阳不足为心衰的主要因素，故温阳法成为心衰病的重要治则之一。心为君主之官，主血脉，属火，为阳中之阳，而肾脏主水及纳气，属水，为人体阴阳之根本，与心衰病的关系尤为密切。心为君火，肾为相火，君火在上，如明照当空，相火在下，系阳气之根。心在上，肾在下，上位者降为和，下位者，升为顺，心之阴阳须降于肾，充养肾阴、肾阳；肾之阴阳需上升至心，以温养心之阴阳。两脏阴阳之间上下交通，相互依存，才能维持阴阳动态平衡，即水火既济，心肾相交，如《慎斋遗书》有云：“心肾相交，全凭升降……升降者水火。”发生心衰时，则为心肾阳气互资障碍，阴阳紊乱［18］，因此，心衰病虽病位在心，但治疗中对肾阳的温补不可忽视。

穴位贴敷治疗是中医外治法中的重要组成部分，其通过药物贴敷特定穴位，让药性缓缓释放，通过经络疏通气血、调理阴阳从而达到治疗疾病的作用［19］。研究表明，穴位贴敷疗法在多种心血管疾病的治疗中有着较好的疗效［20-22］。温阳贴由肉桂、黄芪、艾草组成，肉桂其性大热，味辛、甘，归肾、脾、心、肝经，具有活血通经、补火助阳、引火归元、散寒止痛、温通经脉的功效。黄芪味甘，性微温，归肺、脾、肝、肾经，具有益气固表、升阳举陷之功，是补气佳品。艾草味苦、辛，性温，归肝、脾、肾经，具有温经驱寒之功效，佐以姜汁调和意在增强温通之效。涌泉穴归属足少阴肾经，是本经脉气所出之井穴，“井”者视为万物始生也，故以温阳贴贴敷双侧涌泉穴，旨在徐徐资肾阳，使肾经之气如涌泉涛涛，上达脏腑，温通散寒。本课题组在前期临床观察中发现温阳贴贴敷涌泉穴可有效改善CHF病人的心功能，但相关机制并不明确，本研究结果表明，或许与外泌体、miR-320的调控机制以及UCP2介导的心肌能量代谢机制相关，有望进一步的深入研究以挖掘CHF防治的新靶点。

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（收稿日期：2022-08-24）

（本文编辑王丽）