miR-193b-3p、PAK4过表达对人结肠癌细胞增殖凋亡和迁移侵袭的影响及靶向关系

孙玮螺，刘素英，李思锦，周龙妹，何培元

承德医学院附属医院消化内科，河北承德 067000

结肠癌是世界上第三大常见的癌症，也是癌症相关死亡的主要原因之一，发病率和病死率均有逐年上升趋势。尽管在过去几十年中结肠癌的诊断和治疗取得了一些进展，但患者5年生存率仍为40%～60%［1］。HCT116、SW480、LoVo 是人结肠癌细胞系，常应用于结肠癌的实验研究，其中HCT116 是从一名男性结肠癌患者分离出的结肠癌细胞，适合结肠癌的细胞学功能研究。结肠癌的高发病率和不良预后意味着需要更深入了解其形成和发展的潜在机制，从而开发新的、有效的治疗方法，而寻找能有效阻断癌症发生发展的关键基因才是目前研究的重点［2］。微小核糖核酸（miRNA）作为肿瘤抑制剂或致癌基因，在调节多种恶性肿瘤形成和发展中发挥至关重要的作用［3］。在对结肠癌的相关研究中，陆续发现一些异常表达的miRNAs 可能与其形成机制有关［4］。微小核糖核酸193b-3p（miR-193b-3p）是新近发现的miR-193 家族成员之一，在许多癌症组织和细胞中异常低表达，可能影响肿瘤的形成和发展［5］，但其在结肠癌中的研究鲜见报道。P21 活化蛋白激酶4（PAK4）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，目前认为其作为癌基因，在多种癌症中表达上调，具有促进肿瘤细胞生长的作用［6-7］。生物信息在线软件显示PAK4 的3'UTR 区存在miR-193b-3p 的结合位点，但miR-193b-3p与PAK4在结肠癌作用中的靶向关系尚不明确。2022 年1—8 月，我们观察了miR-193b-3p、PAK4 过表达对人结肠癌细胞系HCT116 细胞增殖凋亡和迁移侵袭的影响，并验证两者的靶向关系。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂、仪器 人结肠癌细胞系HCT116、SW480、LoVo 及人正常结肠黏膜上皮细胞FHC 购自美国典型培养物保藏中心。DMEM 培养基、胎牛血清FBS 购自美国Gibco 公司；RNA 抽取试剂TRIzol 购自北京百奥莱博公司；所有引物购自上海生工生物公司；逆转录试剂盒和PCR 荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa 公司；Lipofectamine 2000 脂质体转染试剂盒购自美国Invitrogen 公司；miRNA 阴性对照miR-NC、miR-193b-3p 模拟物miR-193b-3p mimics、PAK4空载体（PAK4-NC）、PAK4过表达载体（pcDNA3.1-PAK4）、荧光素酶报告基因质粒野生型（PAK4-wt）及突变型（PAK4-mut）购自上海吉玛制药公司；双荧光素酶基因报告试剂盒购自美国Promega公司；CCK-8 试剂盒、Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Transwell小室、基质胶购自美国Corning 公司。ABI 7500 荧光定量PCR 仪购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，流式细胞仪购自美国Becton Dickinson 公司，多功能酶标仪购自瑞士Tecan公司。

1.2 HCT116、SW480、LoVo、FHC 细胞系中miR-193b-3p、P21 活化蛋白激酶4（PAK4）mRNA 测算HCT116、SW480、LoVo、FHC细胞系培养在含10% FBS的DMEM 培养基中（100 U/mL 青霉素、100 μg/mL链霉素），培养环境为37 ℃、5% CO2、饱和湿度。采用RT-PCR 法检测各细胞系中miR-193b-3p、PAK4 mRNA。使用TRIzol 试剂提取各细胞总RNA，将提取的总RNA 逆转录得到cDNA 后，加入各引物，应用PCR 荧光定量试剂盒配置反应系统，在ABI 7500 荧光定量PCR 仪上进行PCR 反应。PCR反应条件：95 ℃、3 min，95 ℃、15 s，62 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共45 个循环。PCR 引物序列如下：miR-193b-3p 正向引物 5'-TCTACAGTGCACGTGTCTCCAG-3'，反向引物 5'-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3'；U6 正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向 引 物 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；PAK4 正向引物5'-TCCCCCTGAGCCATTGTG-3'，反 向 引 物 5'-TGACCTGTCTCCCCATCCA-3'；GAPDH 正向引物5'-CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3'，反向引物5'-GGGTAGAGTCATACTGGAACATG-3'。以U6 作为miR-193b-3p内参，以GAPDH 作为PAK4内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-193b-3p、PAK4 mRNA 的表达水平。HCT116、SW480、LoVo、FHC 中miR-193b-3p 的相对表达量分别为0.29 ± 0.08、0.49 ± 0.07、0.41 ±0.10、1.01 ± 0.04，PAK4 mRNA 的相对表达量分别为2.14 ± 0.18、1.82 ± 0.13、1.91 ± 0.17、1.02 ±0.07，HCT116、SW480、LoVo 与FHC 比较，P均＜0.05。选择miR-193b-3p 的相对表达量最低的HCT116细胞进行后续研究。

1.3 HCT116 细胞分组、转染及转染效率检测 取对数生长期HCT116 细胞，铺于6 孔板，待细胞融合度达70%～80%时，按照Lipofectamine 2000 脂质体转染试剂盒说明书操作进行转染，根据转染物不同分为4组，miR-NC组转染miR-NC，miR-193b-3p组转染miR-193b-3p mimics，miR-193b-3p+PAK4-NC组共转染miR-193b-3p mimics+PAK4-NC，miR-193b-3p+PAK4 组 共 转 染 miR-193b-3p mimics+pcDNA 3.1-PAK4，转染后4 h 更换细胞培养基，转染后24 h收集细胞进行后续实验。采用RT-PCR 法检测各组细胞中miR-193b-3p、PAK4 mRNA，确定miR-193b-3p模拟物的转染效率。miR-NC 组、miR-193b-3p组、miR-193b-3p+PAK4-NC 组、miR-193b-3p+PAK4组miR-193b-3p mRNA相对表达量分别为1.02 ± 0.03、3.86 ± 0.28、3.81 ± 0.31、3.83 ± 0.25，miR-NC 组与miR-193b-3p组比较，P＜0.05；miR-NC组、miR-193b-3p组、miR-193b-3p+PAK4-NC 组、miR-193b-3p+PAK4组PAK4 mRNA 相对表达量分别为0.98 ± 0.03、0.33 ± 0.09、0.36 ± 0.10、1.55 ± 0.17，miR-NC 组与miR-193b-3p 组比较，miR-193b-3p+PAK4-NC 组与miR-193b-3p+PAK4 组比较，P均＜0.05。证明miR-193b-3p 模拟物转染效率较高，符合后续实验要求。

1.4 转染miR-193b-3p 模拟物的HCT116 细胞增殖活性检测 采用CCK-8 实验。将HCT116 细胞按照“1.3”所述方法分组及转染24 h后，接种于96孔板，每组设置4个复孔，转染后在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的条件下继续培养24、48、72 h后，向每孔加入10 μL的CCK-8 试剂，继续培养2 h 后，酶标仪测定450 nm 波长处光密度值（OD），以此代表细胞的增殖活性。

1.5 转染miR-193b-3p 模拟物的HCT116 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。将HCT116 细胞按照“1.3”所述方法分组及转染24 h后，预冷的PBS清洗细胞2 次，预冷的1×Annexin V 结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI充分混匀，室温避光孵育15 min，立即用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.6 转染miR-193b-3p 模拟物的HCT116 细胞迁移及侵袭能力检测 采用Transwell 迁移及侵袭实验。将HCT116细胞按照”1.3”所述方法分组及转染24 h后，以无血清DMEM培养基重悬制备单细胞悬液，侵袭实验时首先Transwell 上室面涂抹Matrigel 胶，将200 μL单细胞悬液加入Transwell上室内，下室加入含10% FBS的DMEM培养基诱导细胞，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的条件下继续孵育24 h 后取出小室，棉签蘸去上室面未穿过滤膜的残留细胞，10%甲醛固定后染色，显微镜下观察计算穿膜细胞数。迁移实验时Transwell上室面不涂抹Matrigel胶，其余步骤同侵袭实验。细胞迁移及侵袭能力以穿膜细胞数表示。

1.7 miR-193b-3p 与PAK4 靶向关系验证 采用双荧光素酶报告基因实验。收集HCT116细胞，以3×104个/孔细胞密度接种于12孔板培养，待细胞融合度达70%～80%时，按照Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒说明书操作进行转染，根据转染物不同将细胞分为4 组：PAK4-wt+miR-NC 组共转染PAK4-wt+miR-NC、PAK4-wt+miR-193b-3p mimics 组共转染PAK4-wt+miR-193b-3p mimics、PAK4-mut+miR-NC 组共转染PAK4-mut+miR-NC、PAK4-mut+miR-193b-3p mimics组共转染PAK4-mut+miR-193b-3p mimics。转染24 h后收集各组HCT116细胞并裂解细胞，应用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞的相对荧光素酶活性。

1.8 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时点细胞OD 值比较 不同时点细胞OD值比较见表1。

表1 各组不同时点细胞OD值比较（）

表1 各组不同时点细胞OD值比较（）

注：与miR-NC组比较，aP＜0.05；与miR-193b-3p组比较，bP＜0.05；与miR-193b-3p+PAK4-NC组比较，cP＜0.05。

组别miR-NC组miR-193b-3p组miR-193b-3p+PAK4-NC组miR-193b-3p+PAK4组细胞OD值72 h 3.74 ± 0.26 1.53 ± 0.15a 1.46 ± 0.13a 2.48 ± 0.11abc 24 h 0.88 ± 0.06 0.40 ± 0.09a 0.44 ± 0.10a 0.60 ± 0.08abc 48 h 1.92 ± 0.21 0.79 ± 0.10a 0.84 ± 0.08a 1.29 ± 0.13abc

2.2 各组细胞凋亡率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较 细胞凋亡率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较见表2。

表2 各组细胞凋亡率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较（）

表2 各组细胞凋亡率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较（）

注：与miR-NC组比较，aP＜0.05；与miR-193b-3p组比较，bP＜0.05；与miR-193b-3p+PAK4-NC组比较，cP＜0.05。

组别miR-NC组miR-193b-3p组miR-193b-3p+PAK4-NC组miR-193b-3p+PAK4组侵袭细胞数（个）230 ± 29 98 ± 17a 104 ± 13a 186 ± 18abc细胞凋亡率（%）4.45 ± 0.91 23.39 ± 4.36a 21.17 ± 3.89a 10.14 ± 1.44abc迁移细胞数（个）324 ± 26 145 ± 20a 152 ± 17a 278 ± 15abc

2.3 miR-193b-3p 与PAK4 的靶向关系验证结果生物信息在线软件Target Scan7.2（https：//www.targetscan. org）在线预测显示，PAK4 的3'UTR 区存在miR-193b-3p的结合位点，结合功能分析预测PAK4可能为miR-193b-3p的靶基因。双荧光素酶报告基因结果显示，PAK4-wt+miR-NC组、PAK4-wt+miR-193b-3p mimics 组、PAK4-mut+miR-NC 组、PAK4-mut+miR-193b-3p mimics 组细胞荧光素酶活性分别为0.99 ±0.03、0.48 ± 0.07、1.02 ± 0.04、1.00 ± 0.03，PAK4-wt+miR-193b-3p mimics组细胞的荧光素酶活性明显低于PAK4-wt+miR-NC 组（P＜0.05），而PAK4-mut+miR-193b-3p mimics 组细胞荧光素酶活性与PAK4-mut+miR-NC组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，随着结直肠镜检率的提高，该病早期诊断率有所提高，早期患者5 年生存率超过90%，但其具有高转移潜能，大部分病例在确诊时已经出现了淋巴结或远处转移。研究［8］显示，高达80%的转移性结直肠癌患者，原发肿瘤在＜0.01 cm3时就已经发生了远处转移。出现转移的结肠癌患者生存期明显缩短，虽然近年来手术、放化疗等治疗手段有了显著进步，但晚期结肠癌治疗效果仍然欠佳，发生远处转移的进展期结肠癌患者5 年生存率仅约为12%。HCT116 是1979 年BRATTAIN 等从一名男性结肠癌患者分离出的结肠癌细胞，是常用于科研的稳定细胞系，适合结肠癌的细胞学功能研究。结肠癌的形成和发展机制是一个多步骤的过程，包括与结肠癌相关的基因或分子的变化。尽管已经确定了一些基因、蛋白质和分子，但尚不能有效阻断结肠癌的形成和发展，因此探索结肠癌发生转移的内在分子机制，对于发现新的治疗方案，提高进展期结肠癌生存率意义重大。

miRNA 是近年分子生物学研究领域里的热点，其通过抑制靶基因的mRNA转录或促进其降解来抑制靶基因蛋白的生成［9］。人类包括肿瘤在内的多种疾病都存在miRNA 表达谱的改变，并且可能起着关键的作用［10］。miR-193b-3p 是近年发现的miRNA 家族成员，其定位于人染色体16p13.12，在乳腺癌［11］、卵巢癌［12］、恶性黑色素瘤［13］等多数实体肿瘤中呈低表达状态，但在宫颈癌［14］等少部分肿瘤中表达升高，说明其在不同恶性肿瘤具有明显的肿瘤异质性。研究发现，miR-193b-3p可以与肿瘤细胞对化疗作用的敏感性相关［15］，并且可以与肿瘤患者的预后密切相关［16］。但目前miR-193b-3p 在结肠癌中的相关研究较少，并且作用机制尚不明确。miRNA 的不同生物学作用，主要是通过其对下游靶基因的表达的调控来实现的［17］。生物信息在线软件Target Scan7.2 在线预测发现，PAK4 的3'UTR 区存在miR-193b-3p 的结合位点，结合功能分析预测PAK4 可能为miR-193b-3p 的靶基因，PAK4 可能为miR-193b-3p在结肠癌发生发展中作用的下游分子通路。PAK4是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，目前认为其作为癌基因，具有明显的促肿瘤细胞生长及转移的作用［6-7］。既往较多研究［18-20］已经证实，上调PAK4表达能够促进结肠癌细胞的生长及转移，下调PAK4 表达能够抑制结肠癌细胞的生长及转移。

本研究我们通过检测人正常结肠黏膜上皮细胞FHC 及人结肠癌细胞HCT116、SW480、LoVo 中miR-193b-3p 表达发现，结肠癌细胞中miR-193b-3p表达明显低于正常结肠黏膜上皮细胞。研究中我们选择选择miR-193b-3p 的相对表达量最低的HCT116 进行后续研究细胞，通过脂质体转染法转染miR-193b-3p 模拟物至HCT116 细胞，成功过表达HCT116 细胞中miR-193b-3p 的表达水平，通过CCK8 实验、Transwell 迁移和侵袭实验、流式细胞术研究结果发现，过表达miR-193b-3p 后，HCT116 细胞增殖活性、迁移及侵袭能力均明显下降，而凋亡率明显升高，说明miR-193b-3p 对结肠癌细胞的生长和转移具有抑制作用。本研究也发现，结肠癌细胞中PAK4表达明显高于正常结肠黏膜上皮细胞。并且本研究通过双荧光素酶报告基因证实miR-193b-3p能靶向结合PAK4的3'UTR区，RT-PCR结果也显示过表达miR-193b-3p能够抑制结肠癌细胞中PAK4 mRNA的表达。进一步本研究通过拯救实验，转染PAK4过表达载体至过表达miR-193b-3p 的HCT116 细胞，结果发现上调PAK4 表达能够部分逆转过表达miR-193b-3p 对HCT116 细胞增殖活性、迁移及侵袭能力的抑制及对凋亡的促进作用，说明miR-193b-3p对结肠癌细胞的生长和转移的抑制作用是部分通过靶向调控PAK4 基因实现的，但miR-193b-3p 可能还存在其他下游分子通路参与对结肠癌细胞的生长和转移调控。

总之，miR-193b-3p在人结肠癌各细胞系中表达降低；转染miR-193b-3p 模拟物可抑制HCT116 细胞增殖、迁移及侵袭，并促进其凋亡，机制可能与其靶向结合PAK4的3'UTR区负向调控PAK4表达有关。