异钩藤碱对大鼠急性胰腺炎细胞的炎症和凋亡改善及ERK信号通路调控作用

寨旭，裴红红，刘俊，黄婉

西安交通大学第二附属医院急诊科，西安 710006

急性胰腺炎（AP）是临床上较为常见的急腹症之一，有较高的发病率和病死率［1］，治疗手段以手术及药物为主，但未能明显提升患者生存质量。炎症是AP的标志，在AP的发展进程中具有极大影响。研究显示，核苷酸寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体与AP进展关系密切，NLRP3炎症小体在机体异常状态时受外源或内源刺激物反向激活，从而促进疾病的发展［2］。因此，减轻炎症是治疗AP的关键。中医药在我国发展历史悠久，AP属中医“腹痛”“胃脘痛”及“脾心痛”等范畴，饮食不节、情志不舒及气机不畅是主要病机，中医药治疗可有效缓解临床症状［3-4］。异钩藤碱（LSO）是从中药钩藤中提取的一种四环羟吲哚生物碱，具有较强的抗炎活性［5］。LSO可抑制1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的神经细胞凋亡及损伤，并通过抑制细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路减轻神经细胞损伤程度，但其在AP 细胞中的作用及机制鲜有报道［6-8］。本研究选用大鼠胰腺腺泡AR42J细胞，并以雨蛙素［9］诱导制备AP 细胞模型，后加入40 μmol/L 的LSO，观察LSO 对大鼠AP 细胞的炎症和凋亡改善及ERK信号通路调控作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、药品、试剂与仪器 大鼠胰腺腺泡AR42J 细胞（上海赛百慷生物技术股份有限公司）。LSO（上海源叶生物科技公司，纯度≥98%），雨蛙素（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥95%），ERK 信号通路抑制剂U0126（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%），ERK 通路激活剂C16-PAF（阿拉丁，纯度≥98%）。胎牛血清（美国Gibco 公司），FK-12 培养基（北京索莱宝科技有限公司），Hoechst 33258 染色试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司），酶联免疫分析（ELISA）试剂盒、5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷（EdU）、细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、逆转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒（杭州主诺生物技术有限公司），RIPA 裂解液（北京索莱宝科技有限公司），半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、凋亡相关的斑点样蛋白（ASC）、ERK 1/2、p-ERK 1/2、NLRP、β-actin 等一抗抗体及二抗包括碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗鼠IgG（H+G）和AP 标记的羊抗兔IgG（H+G）均来源于武汉三鹰生物技术有限公司。HEPA CLASS100型培养箱（美国Thermo 公司），MA-3200Q 型荧光定量PCR 仪（苏州雅睿生物技术股份有限公司），Multiskan Sky High 型酶标仪（美国Thermo 公司），SZ51型倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.2 细胞培养及LSO 加入、最佳剂量筛选 将AR42J 细胞（≥80%密度）接种于的FK-12 培养基中（含20%胎牛血清，37 ℃、5% CO2条件下），换液间隔时间为2～3 d。取对数生长期的AR42J 细胞，并分为6 组，对照组不作处理，模型组及5、10、20、40 μmol/L LSO 组均以100 nmol/L 雨蛙素诱导细胞24 h 构建体外AP 细胞模型，5、10、20、40 μmol/L LSO 组制模后加入5、10、20、40 μmol/L LSO，分别处理24 h 后，加入CCK8 溶液，培养（37 ℃，5% CO2）1 h后，用酶标仪对各孔细胞在450 nm 处的OD 值进行检测，并计算细胞活力。细胞活力（%）=［（模型组或者5、10、20、40 μmol/L LSO 组OD 值-空白组OD值）/（对照组OD 值-空白组OD 值）］×100%。对照组、模型组及5、10、20、40 μmol/L LSO 组细胞活力分别为100 ± 0.00、21.43 ± 3.31、29.48 ± 4.28、45.34 ± 5.58、61.72 ± 8.92、77.25 ± 8.43，对照组与模型组细胞比较，模型组与10、20、40 μmol/L LSO 组比较，P均＜0.05。因此，选择效果最好的40 μmol/L LSO进行后续实验。

1.3 细胞分组、AP 细胞模型制备及40 μmol/L LSO加入 将AR42J细胞分为6组，对照组正常培养，其余5组先制备AP细胞模型（加入100 nmol/L雨蛙素），然后分为模型组、LSO组（再加入40 μmol/L LSO）、抑制剂组（再加入10 μmol/L ERK信号通路抑制剂U0126）、LSO+抑制剂组（再加入40 μmol/L LSO 和10 μmol/L U0126），LSO+激活剂组（再加入40 μmol/L LSO 和0.1 μmol/L ERK信号通路激活剂C16-PAF），为实验更具客观性，每组处理均设置3次重复，培养24 h。

1.4 各组细胞培养液中的炎症因子检测 采用ELISA 法。取各组细胞培养液，离心后取上清液，均按照IL-6、IL-8、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA 试剂盒说明书操作步骤，对IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平进行检测。

1.5 各组细胞增殖率测算 采用EdU 法。采用EdU 对各组细胞进行2 h 孵育，4%多聚甲醛进行固定，然后加入Click 反应液进行30 min 避光孵育，接着进行复染，装片后，EdU 红色荧光信号和Hoechst 33342 蓝色荧光信号均在荧光显微镜下观察并采集（100×），并用Image J软件进行细胞数目确定。细胞增殖率（%）=红色细胞数/蓝色细胞数×100%。

1.6 各组细胞凋亡率测算 采用Hoechst 33258 染色法。各组细胞以PBS 洗涤（2 次/5 min），4 ℃固定（4%多聚甲醛，10 min）。磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤（3 次/5 min），染色液（5 mg/L，Hoechst 33258）染色10 min，PBS 洗涤（3 次/5 min）后封固。荧光显微镜随机拍照（3 个视野）。细胞凋亡特征：呈亮蓝色，核体积变小、浓缩，不均浓染，荧光较强。细胞凋亡率即为凋亡细胞数占总细胞数的百分比。

1.7 各组细胞NLRP3 炎症小体mRNA 测算 采用实时荧光定量PCR（qPCR）法。各组细胞提取总RNA，并进行逆转录反应获取cDNA。参照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书进行qPCR 扩增。反应条件为：94 ℃、5 min 预变性；94 ℃、35 s 变性，58 ℃、35 s 退火，72 ℃、35 s 延伸，设循环35 次。引物序列如下：NLRP3 上游引物5'-CAGACCTCCAAGACCACGACT-3'，下游引物5'-ATCCGCAGCCAATGAACAG-3'；ASC 上游引物5'-TTGCTGGATGCTCTGTATGG-3'，下游引物5'-CCAAGTAGGGCTGTGTTTGC-3'；Caspase-1 上游引物5'-GCAGCA-CAGACTTTCAACATC-3'，下游引物5'-GCAGCAGCAACTTCATTTCTC-3'；β-actin上游引物5'-CCAACCGTGAAAAGATGACC-3'，下游引物5'-GGTACGACCAGAGGCATACA-3'。内参采用β-actin，NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA表达水平用2-ΔΔCt法计算。

1.8 各组细胞ERK 1/2、p-ERK 1/2、NLRP3、ASC和Caspase-1 蛋白测算 采用蛋白免疫印迹（WB）法。将各组细胞重悬并裂解；在4 ℃环境下，以12 000 r/min速度离心10 min，取蛋白上清。利用凝胶电泳（80～120 V 恒压法）进行蛋白分离，再经过电泳法（300 mA 恒流法）进行蛋白转膜。载有蛋白的PVDF 膜在5%脱脂牛奶中进行1 h 的封闭处理（室温环境），对一抗进行过夜孵育处理（4 ℃冰箱），对二抗进行2 h孵育处理（室温环境）。封闭、一抗孵育、二抗孵育和显影之间分别用Tris 洗膜缓冲液进行3～5 次膜洗涤。使用凝胶成像系统对实验结果进行拍照并记录，采用Image J 软件对蛋白电泳图进行灰度值计算。

1.9 统计学方法 采用Graph Pad Prism8.0统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett's t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞炎症因子表达比较 炎症因子表达比较见表1。

表1 各组炎症因子表达比较（pg/mL，）

表1 各组炎症因子表达比较（pg/mL，）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与LSO组比较，cP＜0.05。

组别对照组模型组LSO组抑制剂组LSO+抑制剂组LSO+激活剂组IL-1β 5.21 ± 0.62 24.54 ± 3.75a 15.33 ± 1.98b 14.98 ± 2.13b 7.21 ± 0.87c 22.98 ± 2.14c TNF-α 2.48 ± 0.31 15.27 ± 2.01a 10.28 ± 1.54b 9.67 ± 1.25b 4.02 ± 0.55c 14.29 ± 1.98c IL-6 3.29 ± 0.39 20.62 ± 2.65a 12.68 ± 2.01b 12.22 ± 1.58b 5.29 ± 0.72c 18.02 ± 2.12c IL-8 10.82 ± 1.55 41.31 ± 5.28a 28.45 ± 3.21b 27.31 ± 3.09b 14.29 ± 1.89c 39.22 ± 4.27c

2.2 各组细胞增殖率及凋亡率比较 细胞增殖率及凋亡率比较见表2。

表2 各组细胞增殖率及凋亡率比较（%，）

表2 各组细胞增殖率及凋亡率比较（%，）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与LSO 组比较，cP＜0.05。

细胞凋亡率1.97 ± 0.27 28.33 ± 3.21a 12.31 ± 1.87b 11.99 ± 1.67b 4.29 ± 0.65c 25.38 ± 3.26c组别对照组模型组LSO组抑制剂组LSO+抑制剂组LSO+激活剂组细胞增殖率43.25 ± 5.11 5.28 ± 0.65a 18.29 ± 2.13b 19.21 ± 2.44b 40.55 ± 5.21c 9.22 ± 1.23c

2.3 各组细胞NLRP3炎症小体mRNA相对表达量比较 细胞NLRP3炎症小体mRNA相对表达量比较见表3。

表3 各组细胞NLRP3炎症小体mRNA相对表达量比较（）

表3 各组细胞NLRP3炎症小体mRNA相对表达量比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与LSO 组比较，cP＜0.05。

Caspase-1 1.00 ± 0.00 2.86 ± 0.37a 2.08 ± 0.30b 1.99 ± 0.28b 1.32 ± 0.18c 2.69 ± 0.34c组别对照组模型组LSO组抑制剂组LSO+抑制剂组LSO+激活剂组NLRP3 1.00 ± 0.00 2.13 ± 0.31a 1.54 ± 0.19b 1.49 ± 0.27b 1.12 ± 0.15c 2.03 ± 0.25c ASC 1.00 ± 0.00 2.58 ± 0.43a 1.61 ± 0.25b 1.57 ± 0.29b 1.09 ± 0.18c 2.31 ± 0.33c

2.4 各组细胞ERK 1/2、p-ERK 1/2、NLRP3、ASC和Caspase-1 蛋白相对表达量比较 细胞ERK 1/2、p-ERK 1/2、NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白相对表达量比较见表4。

表4 各组细胞ERK 1/2、p-ERK 1/2、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白相对表达量比较（）

表4 各组细胞ERK 1/2、p-ERK 1/2、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白相对表达量比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与LSO组比较，cP＜0.05。

组别对照组模型组LSO组抑制剂组LSO+抑制剂组LSO+激活剂组Caspase-1 0.29 ± 0.04 1.17 ± 0.18a 0.94 ± 0.11b 0.92 ± 0.18b 0.36 ± 0.04c 1.10 ± 0.12c ERK 1/2 0.21 ± 0.03 0.27 ± 0.04 0.23 ± 0.05 0.24 ± 0.03 0.21 ± 0.04 0.29 ± 0.05 p-ERK 1/2 0.22 ± 0.05 1.21 ± 0.23a 0.85 ± 0.09b 0.88 ± 0.11b 0.39 ± 0.05c 1.07 ± 0.21c NLRP3 0.21 ± 0.05 0.98 ± 0.13a 0.43 ± 0.05b 0.42 ± 0.06b 0.23 ± 0.05c 0.89 ± 0.10c ASC 0.27 ± 0.04 1.45 ± 0.19a 0.91 ± 0.12b 0.89 ± 0.15b 0.40 ± 0.05c 1.25 ± 0.19c

3 讨论

AP 是指患者体内胰酶的异常激活所引起胰腺组织的自身消化，伴有局部或全身性炎症，严重者可导致器官衰竭，威胁患者的生活质量和生命健康［10］。现阶段AP的临床治疗以营养补充、控制胰酶分泌及手术治疗为主，尚缺乏特效手段与策略。胰腺腺泡细胞是机体重要的免疫细胞，也是胰腺炎发生时最直接的“受害者”，AR42J细胞稳定，可诱导出外分泌活性，并伴有广泛的内质网重构。雨蛙素是一种胆囊收缩素受体，能刺激胰腺分泌胰酶和炎症因子，破坏胰脏，常被用于构建AP 模型［11］，筛选AP的药物和机制研究。因此，研究AP发病时介导胰腺腺泡细胞生物学行为的调控，对于寻找新的治疗手段及开发新的治疗药物有重要意义。

随着技术的不断发展，从传统中医药中提取有效成分治疗疾病的手段越来越受到关注。AP 是常见的消化系统疾病，在中医上属于“结胸”，与患者饮食不规律、脾胃和肝胆失调有关［12］。中医药在治疗AP 方面已取得重要进展，如大柴胡汤抑制AP 炎症反应和氧化应激反应［13］。LSO 作为钩藤的有效提取成分，具有较强的抗炎及抗凋亡活性［14］。侯从岭等［15］发现，LSO 可通过上调miRNA-192-5p 抑制TNF-α诱导的人支气管上皮细胞凋亡及炎症因子释放。ZHAO 等［16］发现，LSO 通过miRNA-122-5p/肿瘤蛋白/谷氨酸转运蛋白途径减轻脑出血后铁蛋白沉着症引起的神经损伤。另有研究［17］显示，LSO 通过抑制趋化因子受体1介导的小胶质细胞激活和神经炎症减轻脑缺血/再灌注损伤。以上研究提示，LSO在减轻炎症损伤方向具有较好的作用。但LSO是否可减轻AP 腺泡细胞损伤尚未有报道，AP 的发病机制较为复杂，涉及到多种因素，如炎症、氧化及信号通路等，这些因素相互作用和影响，导致胰酶被激活，进而促进AP 的发展进程［18］。NLRP3 炎症小体作为当前研究较为透彻且功能非常重要的疾病关联因素，其激活与AP的发展密切相关。大承气汤可以有效抑制NLRP3 炎症小体活化，降低炎性因子水平，从而改善重症AP 的功能［19］。说明，找寻有效抑制炎症及NLRP3 炎症小体激活的手段治疗AP 是当前的关键。本文结果发现，40 μmol/L LSO 是AP 腺泡细胞活力的最佳浓度；雨蛙素诱导后细胞培养液中的炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-8 及IL-1β）水平、凋亡率及NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA和蛋白表达水平较对照组升高，增殖率较对照组降低，而后在模型组基础加入LSO 后，LSO 逆转了雨蛙素对细胞上述指标的作用。提示，LSO 可促进AP 腺泡细胞增殖，抑制细胞炎症、凋亡及NLRP3炎症小体激活。

ERK 定位于细胞质，可传递有丝分裂信号，参与调节细胞的各种生理过程［20］。经多项基础研究证实，ERK 信号通路与AP 的发生发展密切相关。ZHANG 等［21］发现，沉默双特异性磷酸酶1 基因通过抑制促有丝分裂原活化蛋白激酶及ERK 等信号通路，抑制AP 小鼠促炎细胞因子释放，进而减轻AP 小鼠症状。另有研究［22］发现，丙二醇海藻酸钠通过调节MEK/ERK 通路减轻雨蛙素诱导的小鼠AP。马彦娟等［23］发现，地塞米松抑制转化生长因子β1/smad/ERK 通路激活，能够减少炎症因子合成、释放，保护胰腺腺泡细胞。以上研究表明，抑制ERK 信号通路激活可有效减轻AP 损伤。现有研究显示，雨蛙素作用下细胞中p-ERK 1/2蛋白表达水平较对照组升高，加入LSO 后，细胞中p-ERK 1/2 蛋白表达水平较模型组降低，说明LSO可下调p-ERK 1/2蛋白表达水平。为进一步观察LSO干预ERK信号通路对AP 细胞炎症、增殖、凋亡及NLRP3 炎症小体的影响，本实验在LSO 组的基础上分别加入了U0126及C16-PAF，结果发现加入U0126 后细胞炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-8及IL-1β）水平、凋亡率、p-ERK 1/2蛋白表达水平、NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA 和蛋白表达水平降低，增殖率升高，而加入C16-PAF 后，细胞上述指标与加入U0126 的趋势相反。提示，LSO 可通过阻断ERK 信号通路促进AP 腺泡细胞增殖，抑制细胞炎症、凋亡及NLRP3炎症小体激活。

总之，LSO 可抑制急性胰腺炎细胞炎症、凋亡及NLRP3 炎症小体激活，并促进细胞增殖，机制可能与其可阻断ERK信号通路有关。