基于网络药理学分析补肾与健脾药配伍治疗骨质疏松症的作用靶点及作用机制 *

尹致远 王世琦 蔡余力※

（1.山东中医药大学第一临床医学院硕士研究生2020级，山东 济南 250014；2.山东中医药大学附属医院关节骨科，山东 济南 250014）

骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是因骨密度和骨质量降低，骨脆性增加，从而使脆性骨折发生风险增加的一种全身性骨病，多见于绝经后妇女及70 岁以上老年人，与年龄增长密切相关［1，2］。中医学认为脾肾两虚是OP的关键病机。通过查找相关文献，选取使用频率较高的补肾药（巴戟天、川牛膝、杜仲、骨碎补、淫羊藿）与健脾药（白芍、白术、党参、黄芪、山药）［3-6］。

网络药理学具有整体性和辨证论治的特点，为解决中药成分复杂、主治多样的难点提供了一种新的科学思路［7］，本研究基于网络药理学，探究补肾健脾中药防治OP的可能机制，为补肾健脾法应用于OP提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料补肾药（巴戟天、川牛膝、杜仲、骨碎补、淫羊藿）与健脾药（白芍、白术、党参、黄芪、山药）的主要活性成分及作用靶点和机制。

1.2 研究方法

1.2.1 获取药物有效成分利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），检索巴戟天、川牛膝、杜仲、骨碎补、淫羊藿、白芍、白术、党参、黄芪、山药十味中药并筛选活性成分，筛选标准设定为生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18［8］，将其整合去重后得到补肾药活性成分与健脾药有效成分。同时使用TCMSP搜集活性成分的相关作用靶点的蛋白名称，并通过Uniprot数据库将所得靶点的蛋白名称转化为官方名称。

1.2.2 获取补肾药与健脾药治疗OP的潜在靶点将“osteoporosis”作为关键词，分别通过DrugBank 数据库、OMIM 数据库、DisGeNET 数据库、TTD 数据库以及GeneCards数据库进行检索与筛选，得到OP疾病靶点。

1.2.3 构建药物活性成分-靶点网络使用Cytoscape 3.8.0绘制药物活性成分-靶点网络图，采用软件内“Network analyzer”选项对该网络图进行计算和分析，得到各活性成分的节点度值。

1.2.4 蛋白质互作网络（PPI）构建将1.2.2 中所得补肾药与健脾药治疗OP的潜在靶点导入数据库，在Organism中选择人类物种，并根据度值对结果进行筛选，获得PPI网络图。

1.2.5 生物过程和通路富集分析使用R 软件安装Bioc-Manager，对1.2.2 中的潜在基因靶点进行基因本体论（GO）富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，以pvalueCutoff=0.05，qvalueCutoff=0.05 为显著性差异界定值。

2 结果

2.1 补肾药与健脾药活性成分将所得数据整合去重后得到补肾药特有活性成分60个、健脾药特有活性成分40个、补肾药与健脾药共有活性成分6 个；预测靶点共得到9709 个，将预测靶点的蛋白名称转化为官方名称后，综合筛选并保留惟一值，得到单纯补肾活性成分的预测靶点199个、单纯健脾活性成分的预测靶点195个。

2.2 药物活性成分-靶点网络分析通过Cytoscape 3.8.0软件得到药物活性成分-靶点网络图。见图1。活性成分节点有106 个，潜在靶点节点有83 个。节点度值排前4位的活性成分分别为槲皮素、木犀草酸、山柰酚、柚皮素。

图1 药物活性成分-靶点网络图

2.3 配伍治疗OP作用靶点的获取结果通过OMIM 等5个疾病在线数据库最终得到OP基因靶点1531个。补肾药与健脾药的预测靶点和OP 疾病相关靶点的交集共83个，其中补肾药治疗OP的特有靶点有6个，健脾药治疗OP的特有靶点有5 个，补肾药与健脾药共有的治疗靶点有72个，体现了补肾药与健脾药治疗OP时存在协同作用。

2.4 PPI网络分析通过1.2.4 的操作，得到补肾药与健脾药配伍治疗OP的PPI的核心靶点。见图2。图中节点大小代表Degree值大小，可见，肿瘤蛋白p53基因（TP53）、雌激素受体1（ESR1）、连环蛋白1（CTNNB1）为筛选中最显著的基因，提示其在OP治疗中发挥关键作用。

图2 核心靶点网络图

2.5 GO富集分析与KEGG富集分析

2.5.1 通过R软件对潜在作用靶点进行GO富集分析潜在靶点在生物过程中富集最显著的是腺体发育、氧化应激反应、对类固醇激素的反应等。同时，在细胞组分中富集最显著的是囊腔、膜筏、膜微区、膜区等；在分子功能中富集最显著的是DNA 结合转录因子结合、受体配体活性、信号受体激活剂活性等。见图3。

图3 GO富集分析结果

2.5.2 KEGG通路富集分析前20 条通路主要涉及糖尿病并发症中的高级糖基化终末产物-受体（AGE-RAGE）信号通路、流体剪应力（FSS）与动脉粥样硬化（Atherosclerosis）等。见图4。

图4 KEGG富集分析条状图

3 讨论

由图1 可见，补肾药与健脾药的配伍可由多种成分通过多条通路作用于多个靶点，而非单一作用。槲皮素是能够有效清除衰老的骨髓间充质干细胞的经典抗衰老活性成分［9］；木犀草素具有抗过敏、抗氧化等作用；山柰酚对OP 具有明显的治疗作用，现已被证实能够增加骨密度、改善骨微结构［10］。山柰酚、槲皮素二者均具有类似植物雌激素抑制骨吸收的作用。FSS 在成骨细胞的增殖和分化过程中起着重要作用，能够诱导内质网（ER）快速释放钙离子，产生钙瞬变，进一步激活能量代谢信号通路。Atherosclerosis 和OP 是相互关联的实体，具有相似的致病机制。

综上所述，本文基于网络药理学研究方法展开预测，补肾药与健脾药配伍可通过“多成分-多靶点-多通路”达到防治OP 的目的，多种成分作用于相同靶点、相同通路协同起效。通过对补肾药与健脾药的多靶点机制分析为进一步研究补肾健脾法治疗OP 提供了新的研究基础和思路。