酒大黄(唐古特大黄)配方颗粒超高效液相色谱指纹图谱及化学模式识别研究*

2024-05-07 05:25许树萍黄凯伟魏家保
中国药业 2024年8期
关键词:唐古特指纹批号

许树萍,黄凯伟,张 辉,魏家保,谭 沛

(1. 华润三九医药股份有限公司,广东 深圳 518110; 2. 华润三九现代中药制药有限公司,广东 惠州 516000)

酒大黄(唐古特大黄)配方颗粒为蓼科植物唐古特大黄Rheum tanguticumMaxim.ex Balf. 的干燥根和根茎经酒炙法炒干并按标准汤剂的主要质量指标加工制成[1]。唐古特大黄又称“鸡爪大黄”,主产于甘肃、青海、西藏等高寒、高海拔地区,据报道,唐古特大黄有泻热攻坚、化瘀行滞、清火解毒消火功效,药用历史悠久,是我国常用传统大宗中药材[2]。酒大黄苦寒泻下作用稍缓,并借酒升提之性,引药上行,善清上焦血分热毒,可用于目赤咽肿、齿龈肿痛的治疗[3]。有研究表明,其主要化学成分包括游离/结合型的蒽醌类、蒽酮类,二苯乙烯类,苯丁酮类,色原酮类,黄酮类及鞣质类化合物[4-7]。其中,酒大黄中的游离/结合型蒽醌类、蒽酮类成分是发挥其泻下作用的关键成分[8]。本研究中根据国家药品监督管理局《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》及2020年版《中国药典》中中药质量标准研究制定技术要求,采用超高效液相色谱(UPLC)法建立酒大黄(唐古特大黄)配方颗粒指纹图谱,同时结合相似度评价,以及聚类分析(CA)法、主成分分析(PCA)法、正交偏最小乘- 判别分析(OPLS - DA)法,对不同原料产地、批次的配方颗粒质量进行评估,探讨主要化学成分间的相关性,为全面控制酒大黄(唐古特大黄)配方颗粒的质量提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Acquity UPLC H - Class Plus 色谱系统(美国Waters 公司),包括四元溶剂管理器(ACQ - QSM)、自动进样器(ACQ-FTN)、原装进口色谱柱温箱(ACQCM)、二极管阵列紫外检测器(ACQ - PDA)、Empower色谱管理系统;XS204 型、XS205 型、XSE205 型电子分析天平(精度均为0.1 mg),ME36S型电子分析天平(精度为0.001 mg),均购自梅特勒-托利多<上海>仪器有限公司;SK3310HP 型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);JC - HH - 8 型恒温水浴锅(青岛精诚仪器仪表有限公司)。

1.2 试药

酒大黄(唐古特大黄)配方颗粒(华润三九医药股份有限公司)21 批,编号为S1-S21,其中S1-S3,S4-S6、S16-S21,S7-S9,S10-S12,S13-S15原料产地分别为青海省果洛藏族自治州玛沁县,青海省黄南藏族自治州河南蒙古族自治县,四川省阿坝藏族羌族自治州若尔盖县,四川省甘孜藏族自治州色达县,甘肃省甘南藏族自治州合作市。没食子酸对照品(批号为110831-201605,含量90.8%),儿茶素对照品(批号为110877 -201604,含量99.2%),番泻苷A对照品(批号为110824-202003,含量97.2%),芦荟大黄素对照品(批号为110795-202011,含量97.5%),大黄酸对照品(批号为110757-201607,含量99.3%),大黄素对照品(批号为110756-201913,含量96.0%),大黄酚对照品(批号为110796-201922,含量99.4%),大黄素甲醚对照品(批号为110758 - 201616,含量99.0%),均购于中国食品药品检定研究院。白藜芦醇-4'-O-β-D-(6''-O-没食子酰)葡萄糖苷对照品(批号为STC3930105,含量98.0%),异莲花掌苷对照品(批号为STC3710105,含量98.0%),莲花掌苷对照品(批号为ST82330105,含量98.0%),芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品(批号为ST79960105,含量98.0%),大黄酚-1-O-β-D- 葡萄糖苷对照品(批号为ST83090105,含量98.0%),大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品(批号为ST15280120,含量98.0%),大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品(批号为ST23870205,含量98.0%),大黄素甲醚- 8 -O-β-D- 葡萄糖苷对照品(批号为ST23870110,含量98.0%),均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司;大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品(上海鸿永生物科技有限公司,批号为040090-202105,含量96.3%);表儿茶素- 3 -O- 没食子酸酯对照品(上海源叶生物科技有限公司,批号为MFCD00075940,含量97.2%);甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:CORTECS UPLC T3 柱(100 mm×2.1 mm,1.6 μm);流动相:甲醇-0.05%磷酸水溶液,梯度洗脱(0~1 min时5%A →20%A,1~9 min时20%A →35%A,9~17 min时35%A →37%A,17~21 min时37%A →48%A,21~24 min 时48%A →60%A,24~30 min 时60%A →100%A,30~35 min 时100%A);流速:0.25 mL/min;检测波长:265 nm;柱温:35 ℃;进样量:1 μL。

2.2 溶液制备

取18种对照品各适量,精密称定,加甲醇溶液制成每1 mL 分别含没食子酸、儿茶素、番泻苷A、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素140,20,20,16,16,16,16,8 μg及其余10种对照品各20 μg的单一对照品溶液。取样品适量,研细,取约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加80%甲醇50 mL,密塞,超声(功率250 W,频率40 kHz)处理30 min,冷却至室温,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验:取同一份供试品溶液,按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次,分别以15 号峰与17 号峰计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积(稳定性、重复性试验同)。结果相对保留时间的RSD为0.01%~0.16%(n= 6),相对峰面积的RSD为0.15%~3.23%(n=6),表明方法精密度良好。

稳定性试验:取同一份供试品溶液适量,分别于室温下放置0,4,8,12,16,24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果相对保留时间的RSD为0.02%~0.37%(n=6),相对峰面积的RSD为0.16%~3.91%(n=6),表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验:取同一批样品适量,按2.2 项下方法制备供试品溶液6 份,按2.1 项下色谱条件进样测定,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果相对保留时间的RSD为0.02%~0.36%(n=6),相对峰面积的RSD为1.13%~5.42%(n= 6),表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立及相似度评价

取样品各适量,按2.2 项下方法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件进样测定,记录色谱图。导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版),形成21批样品的UPLC叠加指纹图谱和对照指纹图谱(见图1和图2);通过与混合对照品溶液色谱图(见图3)比对,指认出18个共有成分。

图1 21批酒大黄(唐古特大黄)配方颗粒的超高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.1 UPLC superimposed fingerprints of 21 batches of Wine - Processed Rhei Radix et Rhizoma(Rheum tanguticum)Formula Granules

图2 酒大黄(唐古特大黄)配方颗粒超高效液相色谱图对照指纹图谱Fig.2 UPLC reference fingerprints of Wine - Processed Rhei Radix et Rhizoma(Rheum tanguticum)Formula Granules

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012 版)评价相似度,结果均大于0.950,表明21 批样品的质量较稳定。详见表1。

表1 相似度评价结果Tab.1 Results of similarity evaluation

2.5 化学模式识别研究

2.5.1 CA

采用SPSS 26.0统计学软件,以21批样品各特征峰面积为变量进行CA 分析,结果见图4。可见,当分类距离为15 时,21 批样品可聚为3 类,S1 - S6、S10 - S11,S7-S9、S12-S15,S16-S21各聚为一类。

图4 聚类分析树状图Fig.4 Tree diagram of cluster analysis

2.5.2 PCA

采用SPSS 26.0统计学软件,对21批样品各特征峰面积的标准化值(Xi)进行PCA,主成分结果以特征值>1为标准提取得到2个主成分(PC1,PC2),计算得特征值和方差贡献率(见表2),主成分因子载荷矩阵见表3。可见,提取的2个主成分能反映酒大黄(唐古特大黄)配方颗粒指纹图谱的大部分信息[9]。

表2 样品主成分分析特征值及方差贡献率Tab.2 Eigenvalue and variance contribution rate of principal component analysis of samples

表3 主成分因子载荷矩阵Tab.3 Loading matrix of principal component factors

峰1-峰3、峰6、峰8、峰10-峰18主成分1载荷较高,表明这14个峰主要反映PC1的信息;峰4-峰5、峰7、峰9 PC2载荷较高,表明这4个峰主要反映PC2的信息。根据表2和表3的数据,由公式Fi=Wi1X1+Wi2X2+…+WijXj(其中,W为主成分中各个变量的权重,由成分矩阵中的第j 列载荷除以对应成分特征值的算术平方根所得),计算得主成分得分F1和F2,主成分得分图见图5。

图5 主成分得分图Fig.5 Scoring plot of principal component analysis

2.5.3 OPLS-DA

采用SIMCA 14.1 软件,以21 批样品的特征峰峰面积为变量进行OPLS-DA 分析(见图6)。结果数据矩阵的解释率参数R2X(cum)= 0.888,模型区分参数R2Y(cum)= 0.715,模型预测参数Q2= 0.523,均符合要求(即R2Y>Q2,Q2≥0.5)。经200 次置换检验,Q2回归线与纵轴的相交点小于0.05,说明模型未过拟合,验证有效,且稳定可靠[10]。21 个样品可分成3 类,以变量投影重要性(VIP)值> 1 为提取标准,得到峰4(异莲花掌苷)、峰7(白藜芦醇-4'-O-β-D-(6''-O-没食子酰)葡萄糖苷)、峰2(儿茶素)、峰17(大黄酚)、峰1(没食子酸)、峰9(番泻苷A)、峰5(莲花掌苷)、峰10(大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷)是影响分类的主要标志性成分。

A. 得分图 B.VIP值 C. 模型交叉验证图6 OPLS-DA分析结果A.Scoring plot B.VIP value C.Cross - verification of modelsFig.6 Results of OPLS - DA

3 讨论

3.1 色谱条件选择

预试验中考察了不同流动相系统(甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%乙酸水溶液),不同流动相的酸比例(甲醇- 0.05%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液)等,不同流速(0.20,0.25,0.30 mL/min),不同柱温(30,35,40 ℃)的影响,确定选择2.1 项下色谱条件,各色谱峰分离效果最好。

3.2 供试品溶液制备方法考察

预试验中考察了多种提取溶剂(水、甲醇、乙醇、60%甲醇、80%甲醇),结果选择80%甲醇时指纹图谱得到的色谱峰峰形较好,系统适用性参数相对较优;还考察了超声提取和加热回流2 种提取方式,结果显示提取方式对指纹图谱的影响较小,在此基础上,考察了提取时间(15,30,45 min),在该范围内,各特征成分能被完全提取,综合考虑,选择30 min 为提取时间。对取样量(0.25,0.50,0.75 g)也进行了考察,当取样量为0.5 g 时,色谱峰的峰高及峰宽相对适中,因此,取样量确定为0.5 g。通过考察确定了供试品溶液最佳制备方法,采用该方法能更好将样品中的游离型蒽醌类、蒽酮类、鞣质类、二苯乙烯类成分充分提取出来,更全面展现各化学成分特点,为进一步的质量评价奠定基础。

3.3 酒大黄配方颗粒不同基源区分研究

前期试验还对不同基源大黄药材配方颗粒的指纹图谱进行了研究[11-15]。取酒大黄(唐古特大黄、掌叶大黄、药用大黄)配方颗粒样品分别按2.1 项下色谱条件进行指纹图谱分析。根据相关报道,白藜芦醇-4'-Oβ-D-(6''-O-没食子酰)葡萄糖苷是唐古特大黄的专属性成分,而莲花掌苷、大黄酸- 8 -O-β-D- 葡萄糖苷、番泻苷A等成分是引起不同基源大黄差异的主要标志性成分,且这些成分在唐古特大黄样品中的含量明显高于其他基源的样品。预试验研究结果显示,酒大黄(唐古特大黄)样品中峰5、峰8 和峰9 的响应值明显高于其他基源的样品,峰7 在其他基源样品中缺失。通过对照品的定位,确定了峰5 为莲花掌苷、峰7 为白藜芦醇-4'-O-β-D-(6''-O-没食子酰)葡萄糖苷、峰8 为大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、峰9 为番泻苷A。与文献报道的结果一致。

3.4 化学模式识别分析

相似度评价结果显示,21 批样品指纹图谱相似度均大于0.950,说明不同的酒大黄(唐古特大黄)配方颗粒样品在化学成分类型及含量上无明显差异。CA,PCA,OPLS-DA 均将样品分为3 类,结果显示,不同样品的化学成分类型一致,但成分的含量存在一定差异,其中S10-S12 样品的原料属同一产地但未聚成同一类,推测该产地原料批次间的差异较大。PCA 通过少数几个主成分来解释多个共有峰间的内部结构,距离越近的样本点间相似度越高,体现批次间的可视化,累积方差贡献率显示,前2 个主成分包含了全部测量指标所具有的主要信息。在OPLS - DA 模型下,以VIP值筛选出了导致各批次间产生差异的8 个标志性成分,后期将对上述成分进行药理学研究,明确其药效差异。目前关于酒大黄的指纹图谱报道较少,未来可以从这8 个成分出发,进一步评价酒大黄(唐古特大黄)饮片、标准汤剂和配方颗粒指纹图谱的相关性,为酒大黄饮片的投料、提取、干燥浓缩、制粒的各个环节提供依据。

3.5 方法评价

本研究中建立了酒大黄(唐古特大黄)配方颗粒UPLC 指纹图谱,该方法简便、重复性较好;并结合化学模式识别研究反映了酒大黄主要化学成分类型及有效成分的特点。所建立的方法适用于快速评定不同批次酒大黄(唐古特大黄)配方颗粒的稳定性和一致性,可为其质量评价提供参考。

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