基于HPLC-DAD 指纹图谱结合化学模式识别的红糖产地溯源方法

张雅淑，黄美婷，吕仕军，陆莉莉，曹轶群，谢彩锋，陆海勤，黎庆涛*，黄智*

（1.广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004；2.广西壮族自治区产品质量检验研究院,广西南宁 530200）

红糖是甘蔗经过压榨、澄清、蒸发、浓缩过程加工而成的一种非分蜜糖（non-centrifugal sugar,NCS）[1],保留了甘蔗中大部分的酚类、黄酮类化合物、维生素、矿物质以及氨基酸等成分[2-5],红糖中营养及活性成分的差异来源于甘蔗原料的差异,原料差异主要受到甘蔗品种、种植地区生态环境和气候等因素的影响[6-10]。随着消费者对天然、健康食品的追求不断增加,正品红糖的市场需求量也在日益增长,然而这也导致了假冒伪劣产品的涌现[11]。因此,通过追溯红糖的产地来遏制假冒和劣质商品的流通,是一种非常有效的手段。

指纹图谱是一种可以反映样品整体在各种条件下的化学特征和规律的技术,常用于复杂样品的鉴定和品质控制[12]。红糖的指纹图谱研究主要采用一系列的分析技术,包括色谱技术[如高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）[13]、气相色谱（gas chromatography,GC）[14]、质谱（mass spectrometry,MS）[15]等]以及光谱技术[如红外光谱（infrared spectroscopy,IR）[16-17]、紫外可见光谱和三维荧光光谱[18]等]。红糖的指纹图谱技术主要应用在质量评估、真伪鉴别和产地溯源。在品质评估方面,陆杨等[13]对35 批药用辅料红糖的紫外全波长融合指纹图谱进行相似度分析,构建了药用辅料红糖的紫外光谱指纹图谱,标定10 个共有峰,为制定药用辅料红糖的品质标准提供依据。在真伪鉴别方面,蔡玮琦等[19]为了将白砂糖、红糖、赤砂糖以及黑糖进行区分,建立了白砂糖、红糖、赤砂糖与黑糖的非糖部分高效液相色谱指纹图谱,结合模式识别发现白砂糖、红糖、赤砂糖以及黑糖之间可以相互区分,从而达到准确区分该类食品的目的。杨婷等[20]通过气相色谱-离子迁移谱技术建立了3 种红糖和3 种赤砂糖挥发性成分指纹图谱,共鉴定出65 种已知物质,主成分分析结果表明红糖和赤砂糖挥发性成分存在明显差异,为红糖和赤砂糖鉴定分析提供了依据。在产地溯源方面,陈其钊等[21]建立了广西、广东和云南21 批红糖的HPLC-二极管阵列检测器（diode array detector,DAD）指纹图谱,结合化学计量学标定13 个共有峰,发现其中11 个成分是造成不同批次样品差异性的主要标记物,可将这3 个产地两两区分。但产地的覆盖率较窄,样本数量不足,对红糖产地溯源的研究还不完善。Chen 等[14]采用气相色谱-嗅觉-质谱联用（gas chromatography-olfactory-mass spectrometry,GC-O-MS）对比分析了来自广东、广西和云南三省的18 批甘蔗红糖中挥发性风味化合物的差异,结果表明建立的正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA）模型鉴别出了可区分红糖产地的4 种化合物。

将色谱指纹图谱与化学计量学方法结合可以充分利用图谱信息对样品进行品质评价[22]。模式识别是化学计量学在红糖化合物鉴定方面的一个重要分支,用于挖掘和可视化图谱信息,从而建立有效的识别模型用于红糖的品质评估和产地溯源[23]。其中,无监督学习系统是常见的模式识别分类方法,可对未标记数据中的隐藏模式进行准确的预测或分类,聚类分析（hierarchical cluster analysis,HCA）和主成分分析（principal component analysis,PCA）是其中常用的两种模型,HCA可对数据进行分类,PCA 可对类别之间的相似性进行评估[24-25]。Chen 等[18]使用紫外可见光谱、三维荧光光谱和质谱,通过PCA 和线性判别法分析图谱数据,能够准确区分天然红糖和商业红糖,建立红糖原料的品质控制方法。

近年来,随着消费者对食品安全的关注度不断提高,红糖的产地溯源问题也备受关注,但目前只有Chen 等[14]和陈其钊等[21]在红糖溯源方面建立了指纹图谱。以上研究虽然取得了一定的成果,但是覆盖范围相对有限,仅涵盖了广西、广东和云南3 个地区；其次,仅分析了21 批和18 批红糖样本,样本数量也不足。本研究对来自广西、广东、云南、贵州和香港5 个红糖主产地的11 家制糖企业的55 批红糖样品进行了深入的研究,通过HPLC-DAD 检测技术,建立5 个红糖主产地特有的指纹图谱和全部产地的共有指纹图谱,并结合共有模式法、相似度评价法和化学计量学法,对55 批红糖样品的指纹图谱进行比对,以期有效区分不同来源的红糖,并准确鉴别不同产地红糖之间的化学成分差异,实现对不同产地红糖的快速准确鉴别,以确保红糖产品的品质与安全。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

从广西、广东、贵州、香港和云南的11 家制糖企业中,选取了55 批红糖样品。其中,广西地区的5 家不同制糖企业分别标记为桂中号（L1～L5）、桂南1 号（M1～M5）、桂南2 号（Z1～Z5）、桂东1 号（X1～X5）和桂东2 号（P1～P5）；广东地区的两家不同制糖企业标记为广东1 号（H1～H5）和广东2 号（G1～G5）；云南地区的两家不同制糖企业标记为云南1 号（N1～N5）和云南2 号（Y1～Y5）；贵州地区的1 家制糖企业标记为贵州号（F1～F5）；香港地区的1 家制糖企业标记为香港号（D1～D5）。

乙腈（色谱纯）:成都市科隆化学品有限公司；三氟乙酸（色谱纯）:天津市科密欧化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）:广东予能实验室设备科技有限公司；超纯水:成都优越科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GRINDOMIX GM200 刀式研磨仪:德国Retsch（莱驰）公司；KQ-500DE 型数控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司；Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×100 mm,2.7µm）色谱柱、Cary 3500 紫外可见分光光度计、Agilent 1260 液相色谱仪:美国安捷伦公司；AL204万分之一电子天平:梅特勒-托利多仪器有限公司；TG20WS 台式高速离心机:湖南湘立科学仪器有限公司；HYC-1378 医用冷藏箱:青岛海尔电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

将烘干的红糖样品用电子天平称取8 g（精确至0.000 1 g）,使用80 mL 无水乙醇溶解在100 mL 离心管中,为使超声过程中红糖不受环境温度升高的影响,在超声波清洗器内加入冰块,使超声全过程保证在低温5～15 ℃下进行,中途温度升高需补加冰块。超声处理（550 W、40 kHz）30 min,将超声处理后的溶液使用4 000 r/min 的台式高速离心机离心8 min 取上清液,将上清液倒入直径为15 cm 的圆形培养皿,置于通风橱使乙醇全部挥发,加入5 mL 超纯水复溶,分别用2、1 mL 超纯水润洗,定容至10 mL 制成供试品溶液。放入4 ℃医用冷藏箱待测[21]。

1.3.2 高效液相色谱检测

1.3.2.1 高效液相色谱条件

红糖指纹图谱高效液相色谱采用Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×100 mm,2.7µm）色谱柱,流动相采用乙腈-0.1%三氟乙酸梯度洗脱,检测波长为270 nm,柱温30 ℃,流速采用0.2～1.0 mL/min 梯度流速,进样量20µL,洗脱程序见表1。

1.3.2.2 精密度、重现性和稳定性测定

称取同一批次红糖样品6 份（X1）,并按照1.3.1方法制备供试品溶液,取其中一份样品连续进样6 次,取另一份样品分别在0、2、4、8、12、24、48 h 进样检测,按照1.3.2.1 指纹图谱色谱条件分别进行检测,选择18 号峰作为参照,并通过Microsoft Excel 软件计算该样品中共有峰的相对峰面积和相对保留时间,计算精密度、重复性和稳定性的相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）,并将6 次测定结果通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.1 版）》软件进行相似度计算。

1.3.3 数据处理

1.3.3.1 共有模式法分析产地特有峰和共有峰

将5 个产地红糖样品的HPLC-DAD 色谱图数据分别导入色谱软件中,分别生成产地各自特有的红糖HPLC-DAD 指纹图谱共有模式。按《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》[26]中的要求,选取分离度好且共有的色谱峰作为参照,计算各产地红糖指纹图谱的相对保留时间,并匹配色谱峰。选择某一产地90% 以上样品中的共有峰,形成该产地特有指纹图谱[27],再选取各产地中均存在的共有峰生成所有产地的共有指纹图谱,通过分析特有峰的保留时间以及共有峰的峰面积来鉴别不同产地的红糖。

1.3.3.2 相似度分析

将1.3.3.1 中建立的产地特有的HPLC-DAD 指纹图谱共有模式和共有的HPLC-DAD 指纹图谱共有模式,分别导入色谱软件进行分析,比较55 批样品各产地组内和组外的相似度差异。

1.3.3.3 基于共有峰峰面积的化学计量分析

将55 批不同产地红糖样品的9 个共有峰峰面积导入在线代谢组学数据分析平台Metabo Analys 统计软件中,以标准化数据为数据源,标准化为“Autoscale samples”,“Pearson”模式为距离测量方式,以“ward”为聚类方法对数据进行聚类分析,得到层次聚类热图。为了研究55 批红糖样品中9 种成分的分布规律,使用在线代谢组学数据分析平台对数据进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 精密度、重复性和稳定性测定结果

经测定精密度、重复性和稳定性的检测,发现6 组指纹图谱共匹配了32 个共有峰,并计算共有峰的相对峰面积（relative peak area,PA）的相对标准偏差（RSD）,结果显示RSD 均低于3%。同时,相似度均超过0.99,证明了仪器的高精密度和试验方法的良好重现性。

2.2 产地特有的指纹图谱共有模式分析特有色谱峰保留时间的差异

生成的产地特有的红糖HPLC-DAD 指纹图谱共有模式见图1,不同产地红糖样品的HPLC-DAD 指纹图谱共有峰的平均相对保留时间见表2。

图1 不同产地红糖的HPLC-DAD 指纹图谱共有模式Fig.1 HPLC-DAD fingerprint patterns of brown sugar from different producing areas

表2 不同产地红糖的HPLC-DAD 指纹图谱共有峰的平均相对保留时间Table 2 Average relative retention time of common peaks in HPLC-DAD fingerprints of brown sugar from different origins

由图1、表2 可知,各产地的红糖HPLC-DAD 指纹图谱显示出较多的共有峰。广西、广东、云南、贵州和香港地区红糖HPLC-DAD 指纹图谱共有模式分别存在共有峰26、20、9、37 个和39 个。平均相对保留时间为1.527、1.670、1.747、1.987 和2.208 的色谱峰为广西特有,广东特有的色谱峰平均相对保留时间为3.915,贵州特有色谱峰平均相对保留时间为0.368 和0.505,平均相对保留时间为1.404、1.437、1.475、1.820、1.854、1.966、1.980、2.141 和2.276 的色谱峰为香港特有。广西、广东、贵州和香港地区红糖分别存在特有峰5、1、2 个和9 个,通过对各地区的特有峰保留时间进行分析,可以初步区分不同产地的红糖。

2.3 产地共有峰峰面积分析及红糖样品指纹图谱

生成产地共有的红糖HPLC-DAD 指纹图谱共有模式见图2。图3 为55 批红糖样品指纹图谱和产地共有的HPLC-DAD 指纹图谱共有模式对照。全部产地共有峰的平均相对保留时间见表3,平均相对峰面积见表4。

图2 产地共有HPLC-DAD 指纹图谱共有模式Fig.2 Common HPLC-DAD fingerprint patterns for producing areas

图3 红糖样品指纹图谱Fig.3 Fingerprint patterns of brown sugar

表3 产地共有HPLC-DAD 指纹图谱共有峰的平均相对保留时间Table 3 The average relative retention time of common peaks in the HPLC-DAD fingerprint of the place of origin

表4 产地共有峰的平均相对峰面积Table 4 The average relative peak area of common peaks

在红糖的HPLC-DAD 图谱中,色谱峰代表不同的化学组分,色谱峰面积的大小代表各组分含量的高低,共有峰的相对峰面积反映所含化学成分的相对含量,RSD 值表示了化学成分间的差异[28]。由图3、表3、表4 可知,产地共有的HPLC-DAD 指纹图谱共确定了9 个共有峰,共有峰的相对保留时间RSD≤1.53%。然而,不同产地红糖中共有峰的平均相对峰面积差异较大,其RSD 值为45.565%～197.088%。这种差异主要是由于红糖来自不同的产地,由于气候、生态环境、原料品种和加工工艺等方面存在一定的差异,因此导致了其化学成分种类及含量的差异。广东、广西、云南、贵州和香港地区的S2 号共有峰的平均相对峰面积分别为 47.592% 、26.873% 、814.853% 、8.683% 和3.111%,通过S2 号共有峰的平均相对峰面积,可以成功地将这5 个产地区进行区分。

2.4 指纹图谱相似度评价

在进行初步的产地判别后,利用相似度评价法对红糖产地组内和产地之间进行分析和鉴别,结果见表5、表6。

表5 红糖样品与所属产地的HPLC-DAD 指纹图谱共有模式间的相似度Table 5 Similarity of common patterns between brown sugar samples and HPLC-DAD fingerprints of their respective producing areas

表6 产地特有红糖HPLC-DAD 指纹图谱与产地共有红糖HPLC-DAD 指纹图谱间的相似度Table 6 Similarity between region-specific HPLC-DAD fingerprints of brown sugar and common HPLC-DAD fingerprints of brown sugar

由表5 可知,广西红糖样品与其HPLC-DAD 指纹图谱共有模式间的相似度为0.533～0.986,广东红糖样品与其HPLC-DAD 指纹图谱共有模式间的相似度为0.686～0.966,云南红糖样品与其HPLC-DAD 指纹图谱共有模式间的相似度为0.436～0.862,贵州红糖样品与其HPLC-DAD 指纹图谱共有模式间的相似度为0.783～0.918,香港红糖样品与其HPLC-DAD 指纹图谱共有模式间的相似度为0.992～0.999。香港红糖样品与其产地特有指纹图谱共有模式之间的相似度较高,红糖样品与各自相应产地的HPLC-DAD 指纹图谱共有模式间的相似度均大于0.9,说明相同产地的红糖样品间所含的化学成分较相似。广西红糖样品与其指纹图谱共有模式间的相似度范围较大,分析原因可能是广西红糖样本数量较多,相对于其他地区更能体现出较大的差异性,但这种差异仍在合理的范围内。云南红糖样品与其指纹图谱共有模式间的相似度较低,由于云南地处低纬高原,蔗区海拔、降雨量、日照时间等自然条件差异显著,使得云南蔗区成为世界上生产条件最复杂的蔗区之一,这些环境因素导致了甘蔗原料的明显差异,进而影响了云南红糖样品的独特性[29]。

表6 显示广西、广东、贵州、香港、云南红糖指纹图谱共有模式与5 个产地共有红糖HPLC-DAD 指纹图谱共有模式间的相似度分别为0.837、0.823、0.915、0.849、0.473,广东、广西和香港的红糖之间相似度差异较小,云南红糖与其他地区相似度存在较大的差异。贵州和云南地区的红糖,可以明显地区别于其他地区,表明贵州和云南的甘蔗品质和特性存在明显差异,从而能够与其他地区的产品立即区分出来。相似度评价虽然能够实现初步的区分,但无法提供更精确的区分结果,为了实现更精细的区分,还需要进行化学计量学分析以得出更深入的结论。

2.5 聚类分析（HCA）法处理共有峰峰面积

使用相似度评价法分析红糖产地,发现贵州和云南的红糖可明显区分,但广东、广西和香港的红糖相似度高,难以区分。因此,需将产地共有指纹图谱中的9 个共有峰结合化学模式法进一步分析,得到的聚类热图见图4。

图4 红糖样品聚类热图Fig.4 Heatmap of brown sugar samples

如图4 所示,5 个地区的红糖样品之间存在明显的差异,每个地区各自聚为一小类,小组间存在明显差异,显示了各地区样本间明显的区别。云南的红糖样品被分为两个子类,这表明云南红糖样本之间存在组间差异,进一步验证了2.4 相似度评价法显示的结果。此外,广东地区的红糖样品中含有较高比例的成分S4、S5、S8 和S9,香港地区的样品含有较多的S4、S5 和S9,广西地区的红糖样品中主要含有成分S4 和S5,贵州地区含有更多的S4 和S6,云南地区的红糖样品中显现出含有较多的成分S1 和S6,这些不同的化学成分分布为区分不同产地的红糖提供了依据。研究结果显示,不同产地的红糖样品化学成分的种类及含量具有明显差异,因此通过聚类分析深入分析这些化学成分的分布情况,可以准确地对红糖产地进行追踪溯源。

2.6 主成分分析（PCA）法处理共有峰峰面积

使用在线代谢组学数据分析平台对数据进行主成分分析和相关性分析,结果见图5。

图5 红糖样品主成分分析Fig.5 Principal component analysis of brown sugar samples

图5A 显示除部分广东红糖样品与广西红糖存在部分重叠外,其他3 个产地的红糖样品2D 得分图呈现出分散的态势,基本可以相互区分,特别是香港和贵州的红糖能够很好地与其他地区的红糖进行区分。

变量载荷图可以反映主成分与变量之间的关系,载荷的绝对值越大,对主成分的影响就越大,而这种影响可以通过载荷所代表的点到原点之间的距离来进行衡量。如果某个点在进行主成分分析之后位置在原点附近,则说明该变量对于样本之间的区别贡献不大[30],由图5B 可知,PC1 主要受S4、S6、S5 的影响,PC2 主要受S6、S2、S7 的影响。

图5C 显示PC1 的方差贡献率为59.9%,PC2 的方差贡献率为17.1%,PC3 的方差贡献率为11.6%,主成分PC1 的方差贡献率最大,PC1、PC2 与PC3 的累计方差贡献率为88.6%。这3 种主成分对模型的贡献较大,可作为鉴别红糖产地的特征性指标。

结果显示不同产地的样品主要受组分S4、S6、S5、S2、S7 的影响。此外,组分S3 与S8 的对称性和平稳性几乎相同,这意味着这两个成分所反映的信息基本相同。主成分分析能够很好地区分广西、云南、贵州和香港的红糖,但部分广东样品无法与广西样品区分,这是因为广东与广西所用甘蔗的品种大多相同,生产工艺相似,并且广西和广东两地都位于我国南部,同属亚热带季风气候区,地理位置相近,气候条件相似,两地的甘蔗都具有雨热同期的特点[31-32]。

2.7 共有峰成分定性定量分析

采用HPLC-DAD 方法,结合对照品比对以进一步确定共有峰成分,结果见图6。

图6 表没食子儿茶素高效液相色谱特征峰Fig.6 Characteristic peaks of epigallocatechin in high performance liquid chromatography

由图6 可知,根据出峰时间（5.368 min）确定S1 号色谱峰为表没食子儿茶素,化学式为C15H14O7。

采用外标法,通过峰面积计算得出样品中表没食子儿茶素的含量,并将红糖样品中的含量结果展示在图7。

图7 红糖样品中表没食子儿茶素的含量Fig.7 Content of epigallocatechin in brown sugar samples

由图7 可知,55 批红糖样品中表没食子儿茶素含量较高,但各批次样品成分含量差异较大。广东地区广东1 号厂家含有表没食子儿茶素平均含量最多,广东2 号厂家含有表没食子儿茶素平均含量最少。因此,即使是同一产地的红糖,各厂家之间的表没食子儿茶素含量也存在差异,这表明表没食子儿茶素的含量与产地无关,可能受到不同加工方式的影响。

3 结论

本研究以5 个主产地的11 家制糖企业的55 批红糖样品作为研究对象,建立产地特有的HPLC-DAD 指纹图谱,发现广西、广东、贵州和香港地区红糖分别存在5、1、2 个和9 个特有峰,可以初步区分不同产地的红糖。产地共有HPLC-DAD 指纹图谱中共确定了9 个共有峰,广东、广西、云南、贵州和香港地区的S2 号共有峰的平均相对峰面积分别为47.592%、26.873%、814.853%、8.683%和3.111%,通过S2 号产地共有峰的峰面积,可以成功地将这5 个产地的红糖进行区分。为了更准确地鉴别红糖产地,采用了HCA 和PCA 两种化学计量学方法分析峰面积,HCA 可以明显区分不同红糖主产地的样品,并得到广西、云南地区红糖样本之间存在差异。PCA 不仅能够区分辨别不同地区的样品,还能清楚地揭示对溯源有影响的成分,并准确评估其贡献大小。本研究建立的红糖溯源量化方法,保证了更科学的红糖产地区分和溯源,为规范市场提供了有力的技术支持和坚实的科学依据。