同时快速检测蔬菜中百菌清和多菌灵的胶体金免疫层析法

许奂源，梁植雯，许景皓，黄苇，尹青春，李斌，江林峰，郭美媛，徐振林*

（1.华南农业大学食品学院广东省食品质量安全重点实验室,广东广州 510642；2.海南省食品检验检测中心,国家市场监管重点实验室（热带果蔬质量与安全）,海南海口 570314；3.广州万联生物科技有限公司,广东广州 510670；4.广东康辉集团有限公司,广东潮州 515638）

百菌清（chlorothalonil,CTN）是一种高效、低毒、广谱的非内吸性有机氯杀菌剂,是全球第二大常用杀菌剂,也是我国常用的杀菌剂之一[1-2],由于其在植物表面有良好的黏着性,具有较长的药效期,被广泛应用于果蔬病害的防治。研究表明,百菌清具有蓄积毒性,人体长期暴露并接触百菌清会引起职业性哮喘、皮肤病等疾病,百菌清对鱼类及水生脊椎动物也存在毒害作用,此外,百菌清的高毒性和持久性也会对环境和食品安全造成严重的影响[3-4]。多菌灵（carbendazim,CBZ）是一种高效、低毒、广谱的内吸性苯并咪唑类杀菌剂,能够对已经受到真菌病害的植物进行内吸治疗[5]。除此之外,多菌灵还被广泛用于造林、园艺等行业。研究表明,多菌灵对水生动物及哺乳动物具有生殖毒性、致突变性、致癌性,还会引起人体的肝病和染色体畸变[6]。在杀菌剂的使用方面,因为单一制剂的长期连续使用,会使病原菌产生抗药性,因此,一般会采用百菌清对植物进行病害防治、采用多菌灵进行病害治疗,交替使用,以达到最佳的防治效果,导致存在百菌清、多菌灵含量超标现象[7-9]。

由于百菌清和多菌灵存在毒性,世界卫生组织在2017 年已将百菌清列为2B 类致癌物。欧盟禁止百菌清和多菌灵使用,GB 2763—2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定大部分蔬菜中百菌清和多菌灵的最大残留限量分别为0.2～5.0 mg/kg 和0.5～5.0 mg/kg。GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》中规定百菌清为水源水和饮用水的必检项。许多国家均制定了相应的最大残留限量标准。百菌清、多菌灵毒性虽低,短时间内无不良反应,但是长时间的蓄积以及其毒性的协同作用,会对人体造成加倍的伤害。因此在蔬菜和其他食品的安全监测中,同时针对百菌清和多菌灵的残留检测非常重要。

目前,百菌清、多菌灵残留的检测方法主要为仪器分析法,包括气相色谱（gas chromatography,GC）法[10-11]、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）法[12-13]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）法[14-15]和液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）法[16-17]等。这些方法均具有较高的灵敏度和准确性,但由于昂贵的使用成本、复杂的操作等局限了其应用。对于现场检测而言,基于抗原-抗体特异性结合的胶体金免疫层析技术（colloidal gold immuno-chromatography assay,GICA）因其具有灵敏、易操作、高通量等优点而被广泛应用[18]。目前,针对百菌清、多菌灵的快速检测方法均为单一对象的检测方法,例如郭乃菲等[19]利用兔多抗建立了百菌清间接竞争酶联免疫吸附（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA）法,万积成等[20]建立了百菌清胶体金免疫层析检测法,蒋文慧等[21]通过制备的单克隆抗体建立的多菌灵酶联免疫吸附法,陈美莲等[22]建立了多菌灵胶体金免疫层析检测法,同时检测的研究鲜见报道。

本研究制备识别百菌清和多菌灵的特异性单克隆抗体,并建立一种快速同时检测百菌清和多菌灵的双信号胶体金免疫层析方法,系统优化影响性能与稳定性的各种检测条件,最后用于番茄、黄瓜、包菜等蔬菜样品的实际检测,以期满足快速检测蔬菜中百菌清、多菌灵残留的现场大批量筛查的需求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样本垫、硝酸纤维（nitrocellulose filter,NC）膜、吸水垫和聚氯乙烯底板:上海金标生物技术有限公司；氯金酸、柠檬酸三钠、多菌灵标准品（纯度99.9%）、百菌清标准品（纯度99.9%）:国药集团化学试剂有限公司；金标复溶液:广州万联生物科技有限公司；羊抗鼠二抗:北京全式金生物技术有限公司；6-氨基己酸、氢氧化钠、N,N-二甲基甲酰胺（dimethylformamide,DMF）:上海麦克林生化科技有限公司；钥孔血蓝蛋白、乳铁蛋白、牛血清白蛋白、蔗糖、吐温-20:默克化工技术（上海）有限公司；Balb/c 小鼠:珠海百事通生物技术有限公司；黄瓜、番茄、包菜:市售；以上试剂均为分析纯,实验用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

划膜仪（HGS510）、裁条机（HGS201）、金标读数仪（GIC-Q）:杭州峰航科技有限公司；烘箱（SKFG-01）:湖北恒丰医疗制药设备有限公司；低温高速离心机（CR22N）:德国Eppendorf 公司；MS 漩涡振荡器（MS3 basic）:德国IKA 公司；高效液相色谱仪（2695）:美国Waters 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 百菌清、多菌灵半抗原的合成

百菌清半抗原H1 合成路线如图1（a）所示。称取2.65 g 百菌清固体、0.3 g 6-氨基己酸、0.3 g 氢氧化钠溶于40 mL DMF,80 ℃加热搅拌反应8 h。反应结束后,用1 mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 值至8 左右,用二氯甲烷萃取除去未反应完全的原料和杂质后,用正丁醇萃取水相后,有机层减压蒸发,干燥后得到百菌清半抗原H1。

图1 百菌清、多菌灵半抗原合成路线Fig.1 Synthetic routes of chlorothalonil and carbendazim hapten

百菌清半抗原H2合成路线如图1（b）所示。称取2.65 g百菌清固体、0.25 g 甘氨酸和0.23 g 氢氧化钠溶于40 mL DMF,合成方法与上述流程一致,得到百菌清半抗原H2。

多菌灵半抗原H1 合成路线如图1（c）所示。在低温下,将1.92 g 多菌灵固体缓慢加入到5 mL 的氯磺酸中,升温至40 ℃反应2.5 h,制得多菌灵-氯磺酸溶液。冰浴搅拌下,将上述制得的多菌灵-氯磺酸溶液滴入50 mL 95% 乙醇中,形成乳白色悬浊液,将反应液过滤,滤液用冷乙醇洗涤后,干燥,得到白色中间产物1。

在室温下,将8 mL 甲酸、12 mL 蒸馏水和5 mL 48% 氢溴酸加进100 mL 圆底烧瓶中,再依次加入3 g白色中间产物1 和1 g 铝粉,升温至65 ℃反应1.5 h,反应结束后将反应液过滤,用50%氢氧化钠溶液将滤液pH 值调节至3 左右,室温反应12 h。将反应液过滤,滤渣依次用蒸馏水和甲醇洗涤,抽干后于室温晾干,得到中间产物2。

在室温下,将0.5 g 氢氧化钠、10 mL 蒸馏水,0.56 g 中间产物2 和0.46 g 溴丁酸依次加入100 mL干净圆底烧瓶中,40 ℃搅拌反应1.5 h 后将反应液过滤,滤液用6 mol/L 的盐酸调节pH 值至7 左右,生成白色固体,持续室温搅拌12 h 后将反应液过滤,滤渣用蒸馏水洗涤,抽干并干燥,得到多菌灵半抗原H1。

多菌灵半抗原H2 合成路线如图1（d）所示。将1.0 g 多菌灵固体溶解于5 mL 浓硫酸中,在冰浴搅拌下滴加5 mL 浓硝酸,低温下持续搅拌30 min,升温至室温,继续反应2 h。在冰浴下用20% 氢氧化钠溶液调节pH 值至8 左右,有黄色固体生成,65 ℃下减压浓缩部分溶剂,继续低温搅拌30 min,过滤,滤渣用蒸馏水洗涤,抽干并干燥,得到棕黄色中间产物1。

将棕黄色中间产物1、锌粉和浓盐酸按照摩尔比为1∶1.2∶1 依次加入30 mL 甲醇溶液中。在70 ℃下回流4 h,反应完成后将反应液减压蒸发除去甲醇溶液后,用20%氢氧化钠溶液调节pH 值调节至8 左右,用二氯甲烷萃取,有机层减压蒸发,干燥后得到多菌灵半抗原H2。

1.3.2 百菌清、多菌灵单克隆抗体的制备

将百菌清半抗原H1、多菌灵半抗原H1 作为免疫半抗原,分别采用活泼酯法偶联钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）和乳铁蛋白（lactoferrin,LF）形成免疫原CTN-H1-KLH 和CBZ-H1-LF,百菌清半抗原H2、多菌灵半抗原H2 作为包被半抗原,分别采用活泼酯法和戊二醛法偶联牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）和形成包被原CTN-H2-BSA 和CBZ-H2-BSA。

用CTN-H1-KLH 和CBZ-H1-LF 免疫Balb/c 小鼠,通过采用ic-ELISA 法测定小鼠血清的效价以及对目标分析物的抑制率,根据结果选择免疫效果最好的小鼠进行聚乙二醇介导的细胞融合实验,将其脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞按5∶1 的比例融合形成杂交瘤细胞,采用有限稀释法进行杂交瘤细胞克隆化培养,选择能够稳定分泌特异性抗体的细胞株扩大培养并制备抗体。通过ic-ELISA 的方法分析比较抗体对百菌清、多菌灵及其结构类似物的特异性。交叉反应率（Y,%）按下式计算。

式中:X0为目标待测物ic-ELISA 方法IC50值；Z0为结构类似物ic-ELISA 方法IC50值。

1.3.3 GICA 方法的建立

1.3.3.1 胶体金探针的制备

采用柠檬酸三钠还原法合成胶体金探针[23-24],准确量取100 mL 超纯水搅拌加热至沸腾后加入4 mL 的10.0 g/L氯金酸溶液,待再次沸腾时加入4 mL 的10.0 g/L 柠檬酸三钠溶液,保持溶液在沸腾温度下加热10 min 直至颜色变成酒红色后停止加热,继续搅拌到其冷却至室温,转移到洁净的玻璃瓶中置于4 ℃避光保存备用。

1.3.3.2 金标抗体的制备

分别用方法1.3.2 所制备的抗百菌清单克隆抗体、抗多菌灵单克隆抗体对方法1.3.3.1 所制备的胶体金探针进行标记,具体标记方法:用0.1 mol/L K2CO3溶液将胶体金溶液调节至合适的pH 值,加入一定量的抗体振荡混匀后,室温反应10 min。加入40µL 100.0 g/L BSA 溶液振荡混匀后,室温反应30 min 封闭未结合抗体的位点。在4 ℃、9 500 r/min 的条件下离心10 min,弃上清液,加入金标复溶液复溶,分别获得金标百菌清抗体以及金标多菌灵抗体。将制备好的两种金标抗体按照1∶1（体积比）混匀后,分装包被在96 孔酶标板中,37 ℃过夜烘干,于4 ℃避光保存备用。

1.3.3.3 试纸条的组装

将不同质量浓度的CTN-H2-BSA、CBZ-H2-BSA 和羊抗鼠IgG 固定于NC 膜上,形成两条检测T 线和一条质控C 线,并于37 ℃干燥箱中干燥12 h。样品垫经样品垫处理液均匀浸泡处理后于37 ℃干燥箱中干燥12 h。免疫层析试纸条由聚氯乙烯底板、吸水垫、NC膜和样品垫组成。将其从上往下依次将吸水垫、NC膜、样品垫组装于聚氯乙烯底板上,用切条机切成4 mm 宽的试纸条,于干燥环境下避光储藏。

1.3.3.4 检测步骤及结果判定

取80µL 待测溶液加至含有金标抗体的酶标微孔中吹打复溶金标抗体,室温反应3 min 后滴加至试纸条样品垫孔中,室温反应5 min,金标读数仪测定并进行定量计算。如图2 所示,对于无待测物的阴性样本,检测线T1、T2上的CTN-H2-BSA、CBZ-H2-BSA 会捕获金标抗体,形成两条红色的检测T 线,C 线的羊抗鼠IgG 会捕获剩余的金标抗体,形成红色的C 线。对于含有待测物的阳性样本,金标抗体会优先与待测物结合,导致T 线的显色强度随着待测物浓度的增加而变浅。当试纸条的C 线无色,结果无效。

图2 GICA 检测示意图Fig.2 Schematic diagram of GICA

1.3.4 GICA 检测条件的优化

为了实现最佳的检测灵敏度、稳定性与显色效果,分别优化标记体系pH 值、抗体添加量、金标抗体用量、T 线抗原包被浓度、样品垫处理液中离子浓度、BSA浓度、吐温-20 浓度、蔗糖浓度及样品前处理条件。在优化过程中,采用金标读数仪读取试纸条T 线和C 线的信号值并进行计算,对比试纸条的T/C 值以及抑制率进行优化选择。抑制率（Y,%）按下式计算。

式中:B0为阴性样品T 线和C 线信号强度比值；BX为阳性样品T 线和C 线信号强度比值。

1.3.5 试纸条的性能评价

1.3.5.1 灵敏度

用上述GICA 检测条件优化所得的药物稀释液配制一系列不同浓度的百菌清（0、1.25、2.5、5、10、20、40µg/kg）和多菌灵（0、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250µg/kg）标准品溶液,分别取80 µL 用于试纸条检测,根据金标读数仪读取试纸条的T/C 值,以纵坐标为B/B0,横坐标为药物浓度作标准曲线。

1.3.5.2 准确性

选择黄瓜、番茄、包菜3 种蔬菜样品,分别添加百菌清和多菌灵（0、125、250、500 ng/mL）标准品溶液,依照优化的样品前处理方法和GICA 方法进行提取检测,通过药物加标回收率以及变异系数对该法的准确性进行评价。加标回收率（Y,%）和变异系数（CV,%）计算公式如下。

式中:CX为药物实测浓度,µg/kg；C0为药物添加浓度,µg/kg；σ为加标回收率的标准差；μ为加标回收率的平均值。

1.4 数据处理

利用Excel 2021 软件对试验数据进行整理与分析,使用Origin 2022 软件进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 抗百菌清、抗多菌灵单克隆抗体性能鉴定

选择保留百菌清的两个氰基,从氰基邻位的卤素原子氯引入含羧基的间隔臂,合成免疫半抗原,采用缩短间隔臂长度的策略合成了异源包被原。选择保留多菌灵的苯并咪唑环和氨基甲酸酯基团的完整性,从苯环的另一端引入含羧基的间隔臂,合成免疫半抗原,同样地,引入氨基基团合成了异源包被原。通过细胞融合、筛选、腹水制备纯化抗体,所得到的两株单克隆抗体性能见图3。

图3 ic-ELISA 曲线Fig.3 ic-ELISA curve

由图3a 可知,抗百菌清抗体ic-ELISA 的IC50为0.12 ng/mL,检测限（IC10）为0.02 ng/mL,检测线性范围（IC20～IC80）为0.04～0.35 ng/mL。由图3b 可知,抗多菌灵抗体ic-ELISA 的IC50为1.93 ng/mL,检测限（IC10）为0.29 ng/mL,检测线性范围（IC20～IC80）为0.58～6.44 ng/mL。

所得到的两株单克隆抗体的亚型见图4。

图4 单克隆抗体亚型Fig.4 Monoclonal antibody subtype

由图4 可知两株单克隆抗体亚型均为IgG1。

单克隆抗体特异性见图5。

图5 单克隆抗体特异性Fig.5 Monoclonal antibody specificity

由图5 可知,抗多菌灵单克隆抗体特异性对比其他选择从氨基甲酸酯基团端引入间隔臂的策略所制备的单克隆抗体,Yan 等[25]制备的单克隆抗体IC50值为0.45 ng/mL,本研究所得到的抗体特异性方面优于其他抗体。抗百菌清单克隆抗体识别的关键表位为氰基部分。Liu 等[26]所制备的单克隆抗体IC50值为0.36 ng/mL,其半抗原合成策略与本文相似,但本研究采用了异源包被原提升了检测的灵敏度。而Okazaki 等[27]采用从无氰基的五氯苯酚引入间隔臂制得的单克隆抗体IC50值为0.4 ng/mL,但其对取代苯类结构类似物交叉反应率很高。这些数据提供了针对取代苯类杀菌剂的半抗原设计思路,广谱性抗体可从无氰基、保留卤素原子氯的原料去进行间隔臂的引入,单特异性抗体可从保留氰基的原料去进行间隔臂的引入。

2.2 试纸条检测条件优化

2.2.1 标记pH 值与抗体添加量

胶体金标记抗体是通过静电吸附作用将抗体结合包裹在胶体金颗粒表面,标记体系的pH 值会影响抗体与胶体金颗粒的吸附效率以及抗体的生物活性[28]。因此通过添加不同量的0.1 mol/L K2CO3溶液来调节标记体系的pH 值,结果见图6。

图6 不同0.1 mol/L K2CO3 溶液添加量的试纸条效果及探针颜色Fig.6 Effects of test strips and probe color with different 0.1 mol/L K2CO3 solution addition amount

由图6 可知,当标记抗体为百菌清单克隆抗体时,随着K2CO3溶液添加量从10 µL 增加为14 µL,试纸条的T/C 值逐渐上升,而随着K2CO3溶液添加量大于14 µL 时,试纸条T/C 值骤降且灵敏度无明显变化。当标记抗体为多菌灵单克隆抗体时,随着K2CO3溶液添加量从10 µL 增加到18 µL,试纸条的T/C 值逐渐下降,在K2CO3溶液添加量为10µL 时,胶体金溶液发生了明显的聚沉现象,而试纸条灵敏度在K2CO3溶液添加量为14µL 时表现为最佳。因此,在K2CO3溶液添加量为14µL 时,两个抗体都表现出了最佳的标记效率。

在最适的pH 值条件下,不同抗体添加量对试纸条检测性能的影响见图7。

图7 不同抗体添加量的试纸条效果Fig.7 Effects of test strips with different antibody addition amount

由图7a 可知,当标记抗体为百菌清单克隆抗体时,随着抗体添加量从4µL 增加到6µL,试纸条的灵敏度逐渐上升,而抗体添加量大于6µL 时试纸条灵敏度骤降。抗体添加量为4～8µL 时,T/C 值上升,因此,选择灵敏度最佳时的抗体添加量6µL 为最佳抗体添加量。由图7b 可知,当标记抗体为多菌灵单克隆抗体时,随着抗体添加量的增加,试纸条的灵敏度呈现上升的趋势,试纸条的T/C 值整体平稳,当抗体添加量分别为7 µL 和8 µL,试纸条的灵敏度与T/C 值均满足要求且无明显变化,考虑到加入太多抗体容易造成探针聚沉的影响[29-30],因此,选择7µL 为最佳抗体添加量。

2.2.2 金标抗体用量与T 线抗原包被浓度

对于试纸条的显色效果及灵敏度,T 线抗原包被浓度以及金标抗体用量也是两个重要的影响因素。固定试纸条质控C 线包被浓度为0.08 mg/mL,结果见表1。

表1 金标抗体用量与T 线抗原包被浓度优化结果Table 1 Optimization of gold-labeled antibody dosage and T-line antigen coating concentration

由表1 中T/C 值与抑制率可知,最佳组合为金标抗体用量为15 µL/微孔、百菌清抗原包被浓度0.21 mg/mL、多菌灵抗原包被浓度1.50 mg/mL。在优化的最佳参数下,试纸条整体的阴性显色效果最佳,同时灵敏度最高,20 ng/mL 百菌清阳性样品抑制率为82.3%,125 ng/mL 多菌灵的阳性样品抑制率为69.3%。

2.2.3 试纸条样品垫处理液优化

在试纸条中样品垫的主要作用为平衡待测样品液的pH 值、盐离子强度及保持层析的均一性和可控性,对试纸条的显色效果、灵敏度有一定的影响[31-32]。

样品垫缓冲液对试纸条检测的影响见图8。

图8 样品垫处理液对试纸条效果的影响Fig.8 Effect of sample pad treatment solution on the GICA performance

由图8 可知,在离子浓度为0～0.2 mol/L 范围内,试纸条T/C 值无明显变化,但当离子浓度为0.4 mol/L 时,百菌清的灵敏度骤降,表明较高的离子浓度破坏了金标抗体的稳定性。随着BSA 浓度的增加,试纸条T/C 值无明显变化,BSA 浓度为0.5%时试纸条抑制率最佳。随着吐温-20 浓度的增加,试纸条的T/C 值与灵敏度呈现下降的趋势,不含吐温-20 时效果最佳。随着蔗糖浓度的增加,试纸条T/C 值变深后无明显变化,当蔗糖浓度为0.5%时,相比更高添加浓度,试纸条抑制率已达到最高。综合试纸条显色强度与灵敏度,样品垫处理液最适配方为含有0.5%BSA 和0.5%蔗糖的0.1 mol/L 磷酸缓冲液。

2.3 样品前处理优化

不同的样品前处理条件将决定药物的提取效率以及样品基质干扰的去除,对试纸条的灵敏度、前处理方法的可行性有着一定的影响,不同样品前处理条件的影响见图9。

图9 不同前处理条件对试纸条效果的影响Fig.9 Effect of preprocessing conditions on GICA performance

2.3.1 提取溶剂选择

为了达到较高的样品中的药物提取效率及降低样品基质所带来的影响,探究了不同的样品提取溶剂所带来的影响。由图9a 可知,当选用正己烷、1% 乙酸-乙腈为提取溶剂时,多菌灵的加标回收率低于40%,百菌清的加标回收率高于160%。选用乙腈和丙酮为提取溶剂时,百菌清和多菌灵的加标回收率为60%～120%,相比之下,丙酮为提取剂时的加标回收率较高于乙腈为提取剂时的加标回收率,因此,选择丙酮为最佳样品提取溶剂。

2.3.2 吸附剂的影响

在样品前处理的过程中,有机溶剂在提取过程中会提取出除目标药物外的其他杂质,需要在后续处理中利用吸附剂吸附和消除样品基质中的糖类、色素以及脂肪酸,以减少杂质对检测的影响。由图9b 可知,样品提取液经过N-丙基乙二胺（primary secondary amine,PSA）和石墨化碳黑（graphitized carbon black,GCB）处理后,百菌清的加标回收率低于10%,多菌灵的加标回收率也略有下降。说明PSA 和GCB 对百菌清和多菌灵都有不同程度的吸附作用,未经吸附剂处理的样品提取液所测得的加标回收率为60%～100%,因此,选择不使用吸附剂对样品提取液进行处理。

2.3.3 氮吹温度的影响

在样品前处理的过程中,氮吹温度会对药物提取效率有明显的影响。由图9c 可知,30 ℃的氮吹温度下加标回收率为80%～100%,而40 ℃和50 ℃的氮吹温度下,百菌清的加标回收率明显下降,多菌灵的加标回收率则几乎没有变化,因此,选择氮吹最佳温度条件为30 ℃。

2.4 试纸条性能评价

2.4.1 灵敏度

按照上述所优化的最优条件下,试纸条的标准曲线见图10。

图10 GICA 的标准曲线及试纸条效果图Fig.10 Standard curve and test strip effect diagram of GICA

由图10 可知,本研究所建立的方法百菌清的检测限为0.08 ng/mL,检测范围为0.08～10.00 ng/mL；多菌灵的检测限为1.95 ng/mL,检测范围为1.95～250.00 ng/mL。

2.4.2 实际样品检测

选择黄瓜、番茄和包菜3 种样品进行添加回收试验,百菌清、多菌灵的添加浓度分别为125、250、500µg/kg,采用上述所优化的最佳条件进行试验,结果见表2。

表2 样品添加回收结果（n=3）Table 2 Recoveries of spiked samples（n=3）

由表2 可知,3 种样品中百菌清的加标回收率为79.2%～112.1%,变异系数为2.5%～18.9%；多菌灵的加标回收率为63.3%～97.5%,变异系数为1.7%～17.5%。

3 结论

本文基于所制备得到的两种能够特异性识别百菌清、多菌灵的单克隆抗体,成功建立了可以同时快速、简便、灵敏检测蔬菜中百菌清、多菌灵残留的双信号胶体免疫层析法。该法对百菌清、多菌灵的检测限分别为0.08 ng/mL 和1.95 ng/mL,线性范围分别为0.08～10.00 ng/mL 和1.95～250.00 ng/mL。在黄瓜、番茄、包菜3 种样品添加回收试验中百菌清的加标回收率为79.2%～112.1%,多菌灵的加标回收率为63.3%～97.5%,变异系数均低于18.9%,所需总检测时间为20 min,表明本研究建立的胶体金免疫层析法具有灵敏、简便、快速等优点,可应用于蔬菜中百菌清、多菌灵残留的现场快速筛查中。