小鼠CD40胞外片段的原核表达及多克隆抗体的制备

曹旗 潘悦 郑宇

摘要：为了探讨CD40抗体与CD40结合对B细胞应答小分子半抗原的增强作用，利用TRIzol法提取BALB/c小鼠脾脏总RNA，并反转录成cDNA;根据CD40的胞外段CDS设计引物，通过PCR扩增目的基因，构建pGEX4T-1-CD40表达载体，进行原核表达及多克隆抗体制备。结果表明，成功扩增了522 bp的目的基因，表达并纯化获得了45 ku的CD40重组蛋白，多克隆抗体抗体不但可与重组蛋白结合，与小鼠脾脏天然CD40蛋白也可以特异性结合。说明CD40重组蛋白表达成功，且制备的抗体有望模拟CD40L为B细胞活化提供第二信号。

关键词：CD40;原核表达;多克隆抗体;半抗原;免疫增强

中图分类号：Q786         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）06-0130-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.06.026           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Prokaryotic expression of mouse extracellular domain of CD40

and preparation of polyclonal antibody

CAO Qi，PAN Yue，ZHENG Yu，WANG Han，REN Hong-lin，HU Pan，

LI Yan-song，ZHOU Yu，LIU Zeng-shan，LU Shi-ying

（College of Veterinary Medicine，Jilin University/Institute of Zoonosis/Key Laboratory of

Zoonosis Research Ministry of Education，Changchun 130062，China）

Abstract： To investigate the enhanced effect of CD40 antibody binding to CD40 on B-cell response to small molecule haptens，in this study， the total RNA of BALB/c mouse spleen was extracted by TRIzol method and reverse transcribed into cDNA; Primers were designed based on the CDS region of the extracellular domain of CD40， and the target gene was amplified by PCR to construct the pGEX4T-1-CD40 expression vector for prokaryotic expression;The polyclonal antibody was prepared. The results showed that the 522 bp target gene was successfully amplified， CD40 recombinant protein of 45 ku was expressed and purified. The antibody obtained by Western-blot detection not only binds to recombinant protein， but also can specifically bind to mouse spleen natural CD40 protein. Those indicated that the expression of CD40 recombinant protein is successful， and the prepared antibody was expected to mimic CD40L to provide the second signal for B cell activation.

Key words： CD40; prokaryotic expression; polyclonal antibody; hapten;immune enhancement

CD40（Cluster of Different 40，CD40）是Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员，在许多细胞如单核细胞、树突状细胞（DCs）、造血祖细胞、成纤维细胞、上皮细胞、B细胞和部分肿瘤细胞系上均有表达[1，2]。CD40与其配体CD40L是免疫调节反应系统中很重要的一对共刺激分子，参与机体T淋巴细胞依赖的B淋巴细胞应答过程[3]。免疫细胞表面的CD40通过与三聚体形式的CD40L结合，提高细胞间的活性氧水平，这些活性氧，尤其是N-乙酰半胱氨酸，可以促進免疫细胞活化、增殖、分化以及记忆细胞的生成，Ig的分泌与类型转换，从而调节机体特异性体液免疫和细胞免疫[4-6]。有文献报道，极少量的CD40抗体就可增强机体的免疫水平。CD40抗体与抗原进入体内后，CD40抗体能够模拟CD40L特异性的与免疫细胞表面的CD40结合，作为B细胞活化的第二信号，无需借助T细胞辅助作用，因此可以更快地刺激机体免疫系统对该免疫原作出反应[7]。研究显示CD40抗体在DNA疫苗、蛋白类、多糖类抗原免疫过程能够发挥佐剂效应。本研究扩增了小鼠CD40胞外段CDS区序列，对其进行原核表达，制备多克隆抗体，为进一步研究CD40抗体对B细胞应答半抗原过程中的免疫增强作用提供基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  实验动物  成年雌性SPF级新西兰大耳白兔和10周龄雌性SPF级balb/c小鼠购自辽宁长生生物技术公司。

1.1.2  试剂  大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态和大肠杆菌（E.coli）DH5α购自北京天根生物科技有限公司;弗氏不完全和弗氏完全佐剂购自美国Sigma公司;反转录试剂盒和PGEX-4T-1质粒购自宝生物工程（大连）有限公司;TRIzol、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ、ES-Taq酶、DL 2000 DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司;PageRulerTM Prestained Marker购自美国Thermo fisher公司;胶回试剂盒、质粒小提试剂盒和Western blot超敏发光液购自北京索莱宝科技有限公司;小鼠抗GST标签抗体和HRP标记的羊抗兔IgG购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.1.3  试验设备  超净工作台购自天津市生物洁净设备厂;PCR仪购自苏州东胜兴业科学仪器有限公司;电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司;离心机、恒温培养箱、水浴锅购自美国Thermo fisher公司;AKTA购自美国GE公司。

1.2  方法

1.2.1  引物设计  从NCBI获取小鼠CD40基因序列（序列号：M83 312.1），选取胞外段即CDS区第58～579位碱基（522 bp）作为目的基因，用Primer Premier 5.0设计上下游引物，分别加入BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点（下划线部分），F：5-CGCGGATCCCTAGGGCAGTGTGTTACGTG-3;R：5-CCG

CTCGAGTCGCATCCGGGACTTTAAAC-3，引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.2.2  小鼠脾脏细胞cDNA的获取  用TRIzol法提取小鼠脾脏总RNA，用反转录试剂盒反转录成cDNA。

1.2.3  目的基因的扩增  以上面cDNA为模板，用设计的引物进行PCR扩增。PCR反应总体系为20 μL：模板2 μL，2×Es Taq MasterMix（Dye）10 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 5 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环;72 ℃延伸10 min。产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。

1.2.4  原核表达质粒的构建  用限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ将PCR产物和PMD18-T载体进行双酶切处理后，使酶切后的目的片段与克隆载体连接，构建重组质粒，转入大肠杆菌E.coli.DH5α感受態细胞，涂布于含有氨苄的LB固体培养基上，37 ℃培养8 h，挑取单克隆菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃培养6 h，送至库美生物科技有限公司测序，序列比对正确的重组质粒命名为PMD18-T-CD40。再用限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切PGEX4T-1和PMD18-T-CD40， 连接后转化至DH5α感受态细胞，涂板后挑取单克隆菌株，测序鉴定，正确的质粒命名为PGEX4T-1-CD40。

1.2.5  重组蛋白的诱导表达  提取上述鉴定正确的重组克隆质粒PGEX4T-1-CD40，转入大肠杆菌Rosetta（DE3）中，涂布于含有氨苄的LB固体培养基上，挑取单克隆菌株，接种于LB液体培养基中培养并测序，取测序正确的单克隆菌株保种;再接种于LB液体培养基中，在37 ℃摇床中培养至对数生长期，经终浓度1 mmol/L的IPTG来诱导重组蛋白表达，37 ℃继续培养2、3、4 h后，进行SDS-PAGE凝胶电泳并染色。

1.2.6  重组蛋白的验证及纯化  使用Western-blot方法，一抗为鼠源GST标签单克隆抗体，用5%的脱脂奶粉2 000倍稀释后，37 ℃孵育1 h;二抗为辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG，用5%的脱脂奶粉4 000倍稀释，37 ℃孵育1 h后显影。大量培养重组菌株，8 000 r/min离心20 min，收集菌体，PBS缓冲液重悬，冰浴下超声破碎，离心取沉淀，进行SDS-PAGE凝胶电泳，用0.25 mol/L的KCl溶液染色30 s，切下白色目的条带，移入另一干净的平皿中，用蒸馏水冲洗，将胶条置于透析袋中在水平电泳槽中进行电泳。用PBS缓冲液透析5次，每次间隔5 h。将收集到的蛋白用PEG 20 000浓缩，测定其浓度，-80 ℃保存备用。

1.2.7  多克隆抗体的制备、纯化及鉴定  取新西兰大白兔，耳缘静脉收集阴性血清备用;初次免疫为500 μg重组蛋白和等体积完全弗氏佐剂混合后乳化，皮下多点注射免疫;然后加强免疫为500 μg重组蛋白和等体积不完全弗氏佐剂混合后乳化，皮下多点注射免疫;免疫周期为14 d/次，免疫次数为4次，心脏采血收集兔血清。利用A蛋白纯化柱经AKTA对抗血清进行纯化，SDS-PAGE分析抗体的纯化情况，Western-blot检测多抗中GST抗体与CD40重组蛋白和GST蛋白的反应性，再用PGEX4T-1空质粒表达的GST包涵体吸附多抗中多余的GST抗体，Western-blot检测吸附后抗体与CD40重组蛋白和GST蛋白的反应性，以及与小鼠脾脏细胞中CD40天然蛋白的结合活性。

2  结果与分析

2.1  CD40目的片段扩增结果

以小鼠脾脏细胞的cDNA为模板，用设计合成的引物进行PCR扩增，产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。结果表明，在522 bp处有明亮的条带（图1），与预期大小相符。

2.2  目的基因和载体酶切产物的鉴定

将PCR胶回收产物和载体pGEX4T-1以BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，载体和目的基因均有明亮的条带（图2），且大小都符合预期。

2.3  CD40重组蛋白的表达及纯化结果

将构建的重组菌株，经IPTG在37 ℃诱导后用SDS-PAGE电泳分析。结果表明，成功表达CD40重组蛋白，在45 ku处有明显条带（图3），与CD40理论分子质量19 ku和GST理论分子质量26 ku之和接近。且2、3、4 h的表达情况良好且相一致，所以确定最佳诱导时间是2 h。切胶纯化后在45 ku处有重组蛋白（图4）。

2.4  CD40重组蛋白的鉴定

利用Western-blot验证CD40重组蛋白，可见在45 ku处有结合带（图5），与预期大小相符，表明CD40胞外段重组蛋白表达成功，且特异性良好。

2.5  多克隆抗体的纯化

经Protein A抗体纯化柱用AKTA对CD40抗血清进行纯化，通过SDS-PAGE电泳分析，结果（图6）显示，重链和轻链较为完整，且杂带较少，纯度较高。

2.6  标签抗体的清除及多克隆抗体的鉴定

以1∶1 000倍稀释纯化的多克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，用Western-blot分别与CD40重组蛋白和PGEX4T-1诱导的GST蛋白反应来检测多克隆抗体的特异性。结果表明，该多抗与二者都能结合（图7），表明其中含有GST标签抗体。经GST包涵体吸附多抗中的GST抗体后，再用Western-blot分别与CD40重组蛋白和PGEX4T-1诱导的GST蛋白反应来检测多克隆抗体的特异性，可见GST蛋白无条带，CD40重组蛋白有反应条带，说明多抗中GST标签抗体被清除，且CD40抗体特异性良好（图8）。用清除GST抗体后的CD40抗体与小鼠脾脏提取的天然蛋白经Western-blot反应有条带，说明该CD40抗体还可以识别CD40天然蛋白（图9），可用于进一步试验。

3  小结与讨论

小鼠的CD40（Cluster of Different 40，CD40）是包含270个氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其中胞外段174个氨基酸，跨膜区22个氨基酸，胞内区74个氨基酸，属于肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员。CD40/CD40L共刺激途径是机体免疫应答过程中非常重要的组成部分，免疫细胞上的CD40通过其胞外区与可溶性的CD40L结合，发挥相应生物学应效[8]。因CD40L是以三聚体的形式在膜外与CD40胞外段结合，故本研究选取了小鼠CD40胞外段CDS区来进行原核表达，初期利用pET-28a和pET-32a质粒构建表达载体，尝试从16～37 ℃温度、多种浓度IPTG以及多种感受态细胞等均未成功表达，猜想可能是因为此序列编码的是膜蛋白，有较强的疏水区，疏水性多肽会抑制翻译过程[9]。而后改用PGEX4T-1質粒构建表达载体，由于PGEX系列载体具有许多优点如载体构建无需考虑SD及RBS序列，表达效率、表达产率均较高，易于表达等优点[10，11]，在37 ℃成功诱表达出重组蛋白。IPTG诱导培养2、3、4 h后显示表达量无明显差异 ，均能表达大量包涵体，所以确定最佳诱导时间为2 h。切胶纯化的包涵体无杂带，纯度较高;多克隆抗体制备成功后，因其中含有GST抗体，故用GST包涵体将其吸附，尽可能减少其他抗体影响，吸附后的CD40抗体能与CD40重组蛋白以及小鼠天然CD40结合，特异性良好，可用于进一步试验。

研究表明，CD40抗体可作为分子免疫佐剂，有着显著的免疫增强效应。Vinuesa等[12]的研究表明，CD40抗体能够在不依赖T细胞辅助的情况下，增强机体对细菌荚膜多糖的反应原性，常伴有树突状细胞、巨噬细胞、内皮细胞以及B细胞显著的再分布和增殖，同时还能维持脾脏中浆细胞的生长，使抗原特异性浆细胞的数量增加。Rycyzyn等[13]研究结果发现CD40抗体可活化和诱导体外静止性B淋巴细胞体外增殖，显示CD40抗体能够使B细胞在状态和数量上发生改变，可增强免疫效果。Barr等[14，15]研究发现将T细胞依赖性抗原与0.5 mg的CD40抗体共同免疫时，机体可以产生很强的针对这种抗原的特异性免疫反应，并且再次单独免疫此抗原时，又可产生一种很强的再次免疫应答，表明这种免疫应答有较强的记忆性，可用于许多疫苗的生产。这些研究均显示CD40抗体具有较强的增强免疫效应，可以作为潜在的免疫佐剂。本研究成功进行了鼠CD40胞外段的原核表达，并制备获得了抗鼠CD40的特异性抗体，为继续研究CD40抗体对机体B细胞应答半抗原的免疫增强作用提供了充足的理论和试验依据。

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