黄燕兰,杨丕琼,刘琨毅,韩利艳,徐亚文,刘娜,沈雪梅,李家华*
(1.云南农业大学茶学院,云南昆明 650201;2.昆明市农业科学研究院,云南昆明 650034;3.宜宾职业技术学院五粮液技术与食品工程学院,四川宜宾 644100)
十里香茶[Cɑmellɑsinensis(L)O.Ktze.cv.Kunming Shilixiang]属中小叶栽培型茶树品种[1-3],在分类学上属山茶科、茶属、茶种,原产于云南省昆明市东郊十里铺,早在唐代便开始栽培种植,至今已有一千多年的生产历史[4]。十里香茶树具有抗寒、抗旱、抗病虫、耐贫瘠等特性,用其鲜叶加工的茶叶因有特殊花香而享有盛名。十里香茶由于工业污染、城乡发展等因素导致其茶园面积不断缩小[3,5],通过后期开展的茶树保护、种苗繁殖推广以及基地建设发展等措施已恢复十里香茶的生产[6]。
近年来,十里香茶开发出了具有外形紧直翠绿显毫、香气嫩香馥郁且高扬持久、汤色黄绿明亮、滋味浓醇鲜爽、叶底肥嫩如花朵特点的高端绿茶,被称为“十里贡茶”,其产品受到消费者的广泛赞誉。十里香茶是云南独特的地方特色品种资源[7],在全面深入研究其品种特性及持续推动其品种保护的同时,如何利用和充分发挥其品种优势,研发适销对路的十里香茶产品,改变目前只生产绿茶一类产品且产品结构单一的现状,也是十里香茶产业必须面对和解决的问题。
基于此,本研究以十里香茶夏季鲜叶为原料,利用正交试验优化十里香夏季花香型红茶(简称十里香红茶)的加工工艺,并采用高效液相色谱法、茶叶生化成分常规分析方法、感官审评方法测定和评价不同工艺制得的十里香红茶的化学品质及感官品质特点,并利用聚类分析、偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)得出最优理化参数,以期为后续十里香红茶开发提供参考依据。
鲜叶:十里香茶一芽二叶,2021 年8 月采于昆明市宜良县昆明农业科学研究院十里香茶园;无水乙醇、没食子酸、茶氨酸、氯化亚锡(均为分析纯):上海源叶生物科技有限公司;甲醇(色谱纯):北京迈瑞达科技有限公司;乙腈(色谱纯)、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、磷酸(均为分析纯):天津市大茂化学试剂厂;茚三酮(分析纯):上海易恩化学技术有限公司;福林酚试剂(分析纯):北京索莱宝科技有限公司;纯净水:昆明珍茗食品有限责任公司;儿茶素(catechin,C)、表儿茶素(epicatechin,EC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、表没食子儿茶素(epigallocatechin,EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)、咖啡碱(caffeine,CA)(标准品纯度均≥98%):上海晶纯生化科技股份有限公司。
HB 10 型恒温水浴锅:德国IKA 公司;JA 10003 型电子天平:上海舜宇恒平科学仪器有限公司;Smart-Q30 型超纯水机:上海和泰仪器有限公司;0.45µm 孔径过滤膜:天津津滕实验设备有限公司;X-5 型紫外可见分光光度计:上海元析仪器有限公司;DHG-9140 型电热恒温鼓风干燥箱:上海中友仪器设备有限公司;1200 型高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography,HPLC):美国Agilent 公司;JY-6 CHZ-IB 型茶叶烘焙机、JY-6CHF-7 B 型红茶发酵机:福建佳友茶叶机械智能科技股份有限公司。
1.3.1 十里香红茶加工工艺
工艺流程:鲜叶萎凋(厚度2 cm)→揉捻(揉捻1 h,按照轻-重-轻原则)→发酵(发酵厚度4 cm,箱内温度及湿度分别保持在28 ℃、91%)→毛火初烘(100 ℃,10 min)→摊凉回潮→足火干燥(50 min)→提香(2 min)→成品茶。
将成品茶磨成茶粉,过筛后装入密封袋置于-4 ℃冰箱保存。
1.3.2 十里香红茶正交试验设计
在前期单因素试验的基础上,对十里香红茶加工过程中的重要工序进行正交试验,以萎凋时间(A)、发酵时间(B)、足火温度(C)作为变量因素设计正交试验,以感官审评、水浸出物、茶黄素为评价指标,正交试验设计如表1 所示。
表1 L16(43)正交试验设计Table 1 Design for orthogonal test using L16(43)
1.3.3 感官审评
感官品质审评以感官总分计算,参照GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》,由5 位专业人员组成品质评定小组,采用专业评语与百分制打分相结合的方式评定茶叶品质,将得出的感官总评进行正交极差分析。
1.3.4 茶叶化学成分检测
水浸出物含量按照GB/T 8305—2013《茶水浸出物测定》进行测定;茶多酚含量按照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》进行测定;游离氨基酸含量按照GB/T 8314—2013《茶游离氨基酸总量的测定》进行测定;茶红素、茶黄素、茶褐素含量按照NY/T 3675—2020《红茶中茶红素、茶褐素含量的测定分光光度法》进行测定。咖啡碱和儿茶素类含量采用高效液相色谱法测定,色谱条件:流动相A为5% 乙腈水溶液(含0.261% 磷酸)、流动相B 为80% 甲醇水溶液,检测波长280 nm,流速0.8 mL/min,进样量5 µL,结束时间24 min,平衡时间6 min,用峰面积含量换算并计算出儿茶素含量,以C、EC、EGC、ECG、EGCG 组分含量之和为儿茶素总量(total catechins,TC)。
每组试验3 次重复,结果以平均值表示;采用SPSS 26.0 进行系统聚类分析十里香红茶品质成分平均值的差异;采用SIMCA 14.1 进行偏最小二乘判别分析。
16 个不同加工工艺组合的十里香红茶感官审评结果如表2 所示,其不同工艺的干茶、茶汤、叶底如图1 所示。感官审评对茶叶品质的评价最直接有效[8],在审评5 项因子的基础上对其开展感官总评的正交试验结果进行极差分析,结果如表3 所示。
图1 十里香夏季花香型红茶不同工艺的干茶、茶汤、叶底Fig.1 Dry tea,tea infusion,and wet tea leaf of different processes of Shilixiang floral black tea in summer
表2 十里香夏季花香型红茶不同工艺组合感官审评结果Table 2 Sensory evaluation results of different process combinations of Shilixiang floral black tea in summer
表3 极差分析结果Table 3 Results of range analysis
由表2、表3 可知,除十里香5 号滋味分数小于80分外,其余茶样5 项因子分数均为80 分以上,萎凋12 h 的十里香红茶茶样分数均较高。
由图1 可知,十里香红茶外形多为紧结较显毫,外形色泽以青褐较润、棕褐较润、乌黑油润为主;汤色以橙黄明亮、橙红明亮、红浓明亮为主。由表2 可知,十里香红茶香气为甜香略带花香和高火香,以甜香略带花香为主;滋味为浓醇、浓醇稍(较)涩、醇甜,以浓醇为主;叶底总体表现为多芽棕红柔软。总体上,十里香红茶感官品质表现较优,这与生化品质成分含量一致。
由表3 可知,16 个不同工艺组合加工的茶样感官品质得分为88.3~93.8,其中有8 个工艺组合产品得分超过90,以十里香9 号得分最高,整体表现较优。由于萎凋过程中的失水、呼吸作用及细胞透性的增大,一些大分子物质趋于水解,其水解产物又提供了形成该香气成分的先质[9-10],且萎凋、香气成分的总量可增至原料鲜叶的10 倍以上;根据R 值可知不同因素对感官审评的影响先后顺序为萎凋时间>足火温度>发酵时间;根据k 值结合感官审评数据得出最佳组合为A3B1C3。
水浸出物含量的高低反映了茶叶中可溶性物质的多少,不仅标志着茶汤的厚薄、滋味的浓强程度,而且在一定程度上能反映出茶叶品质的优劣[11]。茶红素和茶黄素是红茶“红浓明亮”的物质基础[12],其含量的多少及其两者的比例决定了红茶品质的高低。感官审评是对茶叶外形与内质综合评价的结果,其得分高低在一定程度上可以说明茶叶品质的优劣,因此在感官审评的基础上以水浸出物、茶黄素作为辅助验证指标,对其开展分析,其结果见表4。
表4 水浸出物与茶黄素极差分析结果Table 4 Results of range analysis of water extract and theaflavin
由表4 可知,各因素对水浸出物含量影响程度依次为萎凋时间>足火温度>发酵时间,因茶鲜叶在萎凋过程中,水分散失不仅改变其生理特性,而且促进多酚氧化及水解等一系列化学反应,导致部分水解酶活性提高,有利于促进鲜叶中不溶性化合物的水解[13-14],提高水溶性成分[15],水浸出物含量也因此而升高。各因素对茶黄素含量影响程度依次为发酵时间>足火温度>萎凋时间,其含量的高低与湿热作用下儿茶素的氧化息息相关,且高温能使茶黄素加快降解和氧化聚合[16],发酵时间长短则与茶汤亮度相关,因此,在适宜温度条件下,发酵时间易影响茶黄素的含量[17-18]。综上,水浸出物和茶黄素分别决定了红茶茶汤的浓强度和明亮度。由极差分析结果得出,最佳组合为A4B1C4、A1B1C3,其水浸出物和茶黄素含量分别为42.93%、0.31% 和32.56%、0.46%。因感官审评作为主要判断因素,通过正交试验发现十里香红茶9 号(A3B1C3)的水浸出物与茶黄素含量分别为43.38%、0.66%,其与感官审评得出结果相对应,且水浸出物和茶黄素含量较高,故以十里香红茶9 号为最佳组合。
2.3.1 常规品质成分分析
为了对不同工艺组合加工的十里香红茶的品质成分做到系统和全面的掌握,本文对不同工艺组合加工的十里香红茶的生化品质成分进行了分析测定,常规品质成分测定结果如表5 所示。
表5 十里香夏季花香型红茶不同工艺组合常规品质成分测定结果Table 5 Determination results of conventional quality components by different process combinations of Shilixiang floral black tea in summer
从表5 可知,不同工艺组合加工的16 个十里香夏季花香型红茶的茶多酚含量为9.69%~22.68%,其含量随着发酵时间的变化呈波动变化状态;咖啡碱含量为5.18%~5.96%,其变化范围较小且差异不明显;游离氨基酸含量为1.55%~2.96%,其中十里香8 号、十里香9号和十里香10 号3 个茶样的游离氨基酸含量较高;茶红素含量为0.86%~6.71%,其含量最高的是十里香14号茶样,最少的是十里香16 号茶样,发酵和萎凋时间对其含量的影响较明显;茶褐素含量为0.29%~8.93%,整体含量最高的是十里香4 号茶样。
2.3.2 儿茶素组成分含量分析
儿茶素是红茶发酵过程中茶多酚氧化不可缺少的成分[19],同时也是评判红茶发酵程度的主要成分,其对红茶品质的形成具有重要作用[20-21]。不同加工工艺组合中十里香红茶茶样儿茶素组分含量的测定结果如表6 所示。
表6 十里香夏季花香型红茶不同工艺组合儿茶素组分检测结果Table 6 Detection results of catechin components by different process combinations of Shilixiang floral black tea in summer
由表6 可知,萎凋、发酵及足火温度变化过程中C含量为0.44%~0.92%,其含量变化较小但差异明显;EC 含量为0.42%~1.06%,在加工过程中,除十里香红茶5~8 号逐渐下降外,其余茶样均呈现上下波动趋势;ECG 含量为0.27%~1.23%,除了十里香1~6 号茶样含量较高,其余茶样含量变化较小但差异显著;EGC 含量为3.64%~8.14%,含量最高的是十里香9 号茶样,最少的是发酵和萎凋时间都较长的十里香16 号茶样;EGCG 的含量为0.36%~2.52%,含量最高的是十里香9号茶样,较少的是十里香13 号茶样和十里香16 号茶样;TC 为5.79%~12.72%,且在加工后期含量有所降低;各儿茶素组分在不同工艺组合茶样中的变化随着加工中萎凋、发酵及干燥的程度呈现出上下波动状态。16 个十里香茶样以9 号茶样表现较优,其中C、EGC、EGCG 和儿茶素总量表现最明显,其含量分别为0.92%、8.14%、2.52%、12.72%、;茶样苦涩味容易受到酯型儿茶素含量的影响[22],且在不同加工工艺组合中十里香红茶儿茶素含量表现为简单儿茶素含量较酯型儿茶素高,其表明感官审评滋味中简单儿茶素的影响较大。
系统聚类对不同工艺组合十里香红茶的区分结果如图2 所示。
图2 十里香夏季花香型红茶不同工艺组合生化品质成分系统聚类分析Fig.2 Cluster analysis of biochemical quality components of different process combinations of Shilixiang floral black tea in summer
由图2 可知,以常规品质成分及儿茶素组分C、EC、ECG、EGC、EGCG 及TC 开展系统聚类,当欧式平方距离为15 时,16 个不同工艺组合加工的十里香夏季红茶可分为3 大类,第一大类为十里香1 号和2 号茶样,两个茶样皆属轻发酵和低温足火干燥,水浸出物含量最少;第二大类为十里香13 号、15 号和16 号3个茶样,3 个茶样萎凋时间长,水浸出物含量高,茶多酚含量少;其余11 个茶样归为第3 大类,第三大类茶样的萎凋时间除十里香3 号和4 号茶样外,其余9 个茶样的萎凋时间介于第一大类和第二大类之间,第三大类中多数茶样的水浸出物和茶多酚含量也介于第一大类和第二大类之间。
为进一步发现不同工艺组合十里香红茶的化学品质分类差异,本研究在系统聚类的基础上采用具有监督模式的识别方法PLS-DA 对16 个茶样进行分析。以浸出物、茶多酚、儿茶素组分、儿茶素总量、咖啡碱等品质化学成分为X变量,16 个不同加工工艺组合的茶样为Y变量对其开展PLS-DA 分析,分析结果如图3 所示。
图3 十里香夏季花香型红茶不同工艺组合生化品质成分PLS-DA分析Fig.3 PLS-DA analysis of biochemical quality components by different process combinations of Shilixiang floral black tea in summer
由图3A 可知,不同加工工艺组合的16 个十里香红茶可较好地分开,说明16 个十里香红茶可以被PLSDA 模型明确区分。以模型建立时定义的分类Y矩阵设为变量并将其随机排列100 次,其模型以R2和Q2值作为衡量来判断否过拟合标准[23],检验结果如图3B所示,R2为0.393,Q2为-0.276,Q2负值表明该PLS-DA模型较可靠且未存在过拟合现象[24],可用于茶样类别的判别分析;研究表明R2值越大模型越稳定则解释能力就越强[25]。
图3C 载荷图是反映各变量对不同工艺组合十里香红茶在得分图上分布的影响,离密集区越远的变量对红茶分类的影响越大[26],由图3C 可知,水浸出物含量离密集区最远。研究表明变异权重参数(variable importance in projection,VIP)值大于1.0 表示在判别过程中具有重要作用[27]。VIP 值越大,变量在不同16 个工艺组合加工的十里香红茶间的差异越明显[28],由图3D 可以看出,有5 个品质指标VIP 大于1.0,其中水浸出物含量在图中最高,因此可作为区分不同工艺组合加工的十里香红茶的指标。综合系统聚类分析,说明其与PLS-DA 分析方法可用于茶叶加工工艺的研究领域。
本研究中十里香红茶的最优工艺为萎凋时间12 h、发酵时间2 h、足火温度80 ℃,此工艺制成的十里香红茶感官评分达到93.8,此工艺条件下的十里香红茶的水浸出物含量、氨基酸含量和茶黄素含量最高;系统聚类可将16 个不同工艺组合加工的茶样按萎凋程度、水浸出物含量高低等聚为三大类;基于PLS-DA和系统聚类,可将茶样中主要化合物较明显区分。本研究后续还需丰富十里香红茶工艺数据,如不同等级、不同工艺组合及采摘季节等样品,同时补充完善可溶性糖、茶黄素单体及香气物质等品质成分,以建立更加科学、合理的评价体系,对十里香夏季红茶综合品质进行评价和预测。