低温胁迫联合乳酸菌发酵对藜麦富集γ-氨基丁酸的影响

黄振勇，淡明，韦馨平，周主贵，梁晓君，张娥珍*

（1.广西农业科学院农产品加工研究所,广西南宁 530007；2.广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室,广西南宁 530007；3.南宁市农业科学研究所,广西南宁 530021）

藜麦（ChenopodiumquinoɑWilld）又名印地安麦、南美藜,原产于南美安第斯山脉的高海拔地区[1],藜麦营养价值极高,被称为“营养黄金”[2-3],藜麦富含黄酮、多酚、皂苷、γ-氨基丁酸等活性成分[4],此外还富含人体必需的氨基酸和非必需氨基酸,特别是含有其他谷物没有的赖氨酸和组氨酸[5-6]。藜麦被联合国粮食与农业组织认定为能满足正常人体所需全部营养物质的单一作物,其生理功效多,可作为糖尿病人群的主食[7]。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是一种非蛋白质类氨基酸,具有降血糖[8]、降血压[9]、缓解阿尔兹海默症[10]、抗衰老[11]、改善睡眠质量[12]等保健功能。GABA 广泛存在于谷物、果蔬中,具有缓解焦虑、降血压、调控体质量等多种生物活性,但天然谷物中GABA含量普遍较低,采用植物代谢（发芽）及微生物发酵等处理可有效富集GABA[13-14]。研究表明,植物代谢萌发处理能调整谷物营养结构、改善感官特性、提高谷物营养价值和保健功能；微生物发酵处理可改善食品风味、提高营养价值,因此,可考虑采用适当手段提高藜麦营养价值[15-16]。目前在藜麦的生长发育、营养价值、功能成分、基因分析及生理功能方面已有大量的研究,藜麦萌发期营养与功能成分变化、GABA 的富集及藜麦芽食品开发等藜麦精深加工产品研究也逐渐成为热门[17-19]。本文对低温胁迫联合乳酸菌发酵富集藜麦GABA 工艺进行研究,以期为提高藜麦中GABA 含量和藜麦功能产品精深加工研发提供技术参考,对藜麦产业的健康发展具有一定意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白藜麦:市售；植物乳杆菌LK-1:中国工业微生物菌种保藏管理中心；γ-氨基丁酸（标准品）:上海源叶生物科技有限公司；次氯酸钠、无水乙醇（均为分析纯）:成都市科隆化学品有限公司；硼酸（分析纯）:天津市科密欧化学试剂有限公司；苯酚（分析纯）:成都金山化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

人工气候箱（RGX-250B）:绍兴市景迈仪器设备有限公司；电热鼓风干燥箱（WGLL-230BE）、高速万能粉碎机（FW80）:天津市泰斯特仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-6100）:上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GABA 标准曲线的制定

采用Berthelotb 比色法进行测定[20]。分别将GABA 标准液（1 mg/mL）稀释成浓度为0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mg/mL 的梯度液,准确吸取0.5 mL 各梯度液于比色管,依次加入pH9.0、浓度为0.2 mol/L 的硼酸缓冲液0.2 mL、6% 苯酚溶液1 mL 和10% 次氯酸钠0.4 mL,涡旋振荡器混合均匀,98 ℃水浴反应7 min,取出后立即冰水浴,出现蓝绿色后加入60%乙醇溶液2 mL,于630 nm 处测定吸光值,得回归方程:y=2.896 4x+0.041 8,R²=0.999 1。

1.3.2 藜麦萌发处理

参考马丽等[21]和陈益胜等[22]的方法稍作修改,选择籽粒饱满、完好、无损坏的白藜麦,用0.1%次氯酸钠溶液浸泡30 min,随后用无菌水冲洗4 次,加入2 mg/mL谷氨酸钠溶液没过藜麦,浸泡3 h 捞出沥干,平铺于塑料盘中进行低温胁迫处理,处理完成后取出,无菌水浸泡使其恢复到室温,捞出沥干平铺于4 层纱布培养盘中,放置于人工气候箱中避光培养,萌发结束后65 ℃热风烘干至恒重,粉碎,过60 目筛,备用。同时,以不作任何处理的原藜麦（ck1）作为空白对照,考察发芽对藜麦GABA 含量的影响。

1.3.3 发芽藜麦发酵处理

准确称取15 g 发芽后烘干、粉碎好的藜麦粉,按料液比1∶10（g/mL）添加无菌水,加入6 mg/mL 抗坏血酸,混匀溶解,接种乳酸菌菌种,随后置于人工气候箱中恒温发酵,定时取样测定样品中GABA 含量。同时,以未发酵的发芽藜麦粉（ck2）作空白对照,考察发酵对藜麦GABA 含量的影响。

1.3.4 样品中GABA 含量测定

取粉碎后的样品3.0 g 于100 mL 三角瓶中,加入50 mL 蒸馏水,在超声波清洗器中超声提取90 min,8 000 r/min 离心15 min 取上清液,准确移取上清液0.5 mL,按标曲方法测定上清液中GABA 含量。

1.3.5 发芽工艺单因素试验

根据单因素变量原则,分别在胁迫温度为4、0、-7、-15、-24、-36、-80 ℃,胁迫时间为1、2、3、4、5、6 h,发芽温度为26、29、32、35、38 ℃,发芽时间为6、12、18、24、30 h 情况下,测定发芽后藜麦中GABA 含量。

1.3.6 发芽工艺正交优化试验

在单因素基础上,选择合适的因素水平设计L9（34）正交试验进行藜麦发芽工艺条件优化。正交因素与水平见表1。

表1 发芽正交试验Table 1 Germination orthogonal experiment

1.3.7 发酵工艺单因素试验

准确称取15 g 发芽后烘干、粉碎好的藜麦粉,按料液比1∶10（g/mL）添加无菌水,加入6 mg/mL 抗坏血酸,混合均匀。根据单因素变量原则,分别测定在乳酸菌接种量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.3%、3.0%,发酵温度为28、32、36、40、44 ℃,发酵时间为6、12、18、24、30 h 情况下发酵藜麦中GABA 含量。

1.3.8 发酵工艺正交优化试验

根据发酵条件单因素试验结果,选择合适的因素水平进行乳酸菌发酵藜麦富集GABA 工艺优化,因素水平见表2。

表2 发酵正交试验Table 2 Fermentation orthogonal experiment

1.4 数据处理与分析

所有指标均进行3 次重复试验,结果以平均值±标准差表示,试验数据用Excel 软件处理,用Origin pro 2017进行显著性分析并绘图,P<0.05 表示具有显著性差异。

2 结果分析

2.1 胁迫温度对发芽藜麦γ-氨基丁酸含量的影响

藜麦采用不同温度胁迫后再进行萌芽培养,藜麦种子富集的GABA 含量有较大差异。不同胁迫温度对藜麦GABA 含量影响见图1。

图1 胁迫温度对藜麦GABA 含量影响Fig.1 Effects of stress temperature on GABA content in quinoa

如图1 所示,以低温胁迫藜麦种子后再进行萌发培养,发芽后藜麦GABA 含量较原藜麦（ck1）均有所提高；在胁迫温度为-7 ℃时,藜麦中GABA 含量达到了1.36 mg/g,是原藜麦（ck1）的3.29 倍；继续降低胁迫温度,发芽藜麦富集GABA 能力有所下降,在胁迫温度低于-24 ℃时,发芽藜麦中GABA 含量没有较大变化。胁迫温度造成发芽藜麦GABA 含量存在差异的原因可能是适当的胁迫温度使藜麦中谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase,GAD）被激活,促进谷氨酸脱羧形成GABA,但是胁迫温度过低,酶活被抑制,谷氨酸不能完全脱羧,导致GABA 积累受阻,因此含量有所下降[21]。由试验结果可知,胁迫温度选择在0～-15 ℃之间较为合适。

2.2 胁迫时间对发芽藜麦γ-氨基丁酸含量的影响

胁迫时间对藜麦GABA 含量影响见图2。

图2 胁迫时间对藜麦GABA 含量影响Fig.2 Effect of stress time on GABA content in quinoa

如图2 所示,在胁迫时间为4 h 时,同条件下培养,发芽藜麦中GABA 含量达1.38 mg/g,是原藜麦（ck1）的3.34 倍；继续延长胁迫时间,GABA 含量有所降低,原因可能是当胁迫时间较长时,为了抵抗逆环境,合成的GABA 经GABA 转氨酶转变成琥珀酸半醛,琥珀酸半醛又经琥珀酸半醛脱氢酶转变成为琥珀酸,随后进入三羧酸循环,因此导致GABA 含量有所消耗[23]。从试验结果可知,藜麦低温胁迫时间在3～5 h 较为合适。

2.3 发芽温度对发芽藜麦γ-氨基丁酸含量的影响

适宜的环境温度对种子的发芽具有促进作用,低温胁迫后的藜麦种子在不同环境温度中萌发对GABA含量的积累具有较大影响,发芽温度对藜麦GABA 含量影响见图3。

图3 发芽温度对藜麦GABA 含量影响Fig.3 Effect of germination temperature on GABA content in quinoa

如图3 所示,不同发芽温度下,发芽后GABA 含量均比原藜麦（ck1）有所提高；在发芽温度低于32 ℃时,发芽藜麦中GABA 快速积累,在发芽温度达到32 ℃时,GABA 含量达到了1.49 mg/g,是原藜麦（ck1）的3.61 倍；在发芽温度高于32 ℃时,GABA 含量有所下降。产生此现象的原因可能是随着发芽温度逐渐升高,GAD 酶活能力提高,GABA 含量快速积累,但是温度过高,有害微生物容易滋生,藜麦中营养物质遭到破坏,引起GAD 酶活能力下降,因此积累的GABA 含量有所减少[24]。由试验结果可知,发芽温度在29～35 ℃藜麦发芽积累GABA 含量较佳。

2.4 发芽时间对发芽藜麦γ-氨基丁酸含量的影响

发芽是植物种子利用自身贮藏的营养物质成长为幼苗的过程,不同程度的萌发对种子内部营养物质的损耗不同,发芽时间对藜麦种子GABA 含量影响见图4。

图4 发芽时间对藜麦GABA 含量影响Fig.4 Effect of germination time on GABA content in quinoa

如图4 所示,随着发芽时间的延长,发芽藜麦中GABA 含量逐渐积累,在发芽时间为18 h 时,GABA 含量达到了1.47 mg/g,是原藜麦（ck1）的3.56 倍；在发芽时间18 h 以上时,GABA 含量有所下降,主要原因可能是发芽时间过长,在转氨酶作用下GABA 转变为其他物质,导致含量下降[25]。同时,发芽时间过长容易滋生有害细菌,导致腐烂、变质,从而影响GABA 含量。因此发芽时间在12～24 h 比较适合。

2.5 发芽工艺正交优化试验

在单因素基础上,设计L9（34）正交试验对胁迫温度、胁迫时间、发芽温度和发芽时间4 个因素进行工艺优化,结果如表3、表4 所示。

表3 发芽工艺正交优化Table 3 Orthogonal optimization of germination process

表4 发芽工艺正交试验方差分析Table 4 Variance analysis of germination process orthogonal experiment

由图3 可知,各因素对低温胁迫藜麦发芽富集GABA 工艺影响次序为发芽时间>胁迫温度>发芽温度>胁迫时间。正交试验组合中A2B3C1D2组合GABA 含量为1.61 mg/g,为试验组中含量最高,但直观分析得到组合A2B3C3D2为最佳,分别对这两组工艺进行验证,结果显示,采用工艺组合A2B3C3D2藜麦发芽后GABA 含量为（1.71±0.01）mg/g,高于组合A2B3C1D2,是原藜麦（ck1）的4.14 倍,因此,确定工艺组合A2B3C3D2为最佳发芽工艺,即胁迫温度为-7 ℃,胁迫时间为5 h,发芽温度为35 ℃,发芽时间为18 h。4 个因素中,发芽时间对藜麦GABA 含量的积累有显著影响（P<0.05）。

2.6 乳酸菌接种量对发芽藜麦γ-氨基丁酸含量的影响

接种量大小对乳酸菌在发酵底物中的生长繁殖速度具有较大影响,在接种一定量乳酸菌菌种后,发芽藜麦中GABA 含量变化见图5。

图5 乳酸菌接种量对发芽藜麦GABA 含量影响Fig.5 Effect of lactic acid bacteria inoculation amount on GABA content in germinated quinoa

如图5 所示,相同发酵时间内,随着乳酸菌接种量的提高,GABA 含量有较大变化,在接种量为2.0%时,GABA 含量最高达到了2.17 mg/g,是发酵前藜麦（ck2）的1.27 倍,是原藜麦（ck1）的5.26 倍；继续提高接种量,GABA 含量有所下降,原因可能是接种量过大引起藜麦中乳酸菌生长过于旺盛,容易出现菌种衰老,导致发酵效率下降[26]。因此乳酸菌接种量为2.0% 左右较为合适。

2.7 发酵温度对发芽藜麦γ-氨基丁酸含量的影响

温度是微生物生长繁殖的重要因素,不同发酵温度下,乳酸菌发酵对藜麦GABA 含量的影响见图6。

图6 发酵温度对发芽藜麦GABA 含量影响Fig.6 Effect of fermentation temperature on GABA content in germinated quinoa

如图6 所示,在发酵温度较低情况下,藜麦中GABA 含量积累较缓慢,随着发酵温度的升高,GABA含量积累较快,在发酵温度为36 ℃时,藜麦GABA 含量最高达到了2.05 mg/g,是发酵前藜麦（ck2）的1.20 倍,是原藜麦（ck1）的4.96 倍。适当提高发酵温度有利于乳酸菌的生长繁殖,从而促进GABA 的积累。因此,接种乳酸菌后发酵温度36 ℃左右较为合适。

2.8 发酵时间对发芽藜麦γ-氨基丁酸含量的影响

合理控制发酵时间是降低生产成本、实现经济效益最大化的关键,不同发酵时间内,乳酸菌发酵对藜麦GABA 含量的影响见图7。

图7 发酵时间对发芽藜麦GABA 含量影响Fig.7 Effect of fermentation time on GABA content in germinated quinoa

如图7 所示,随着发酵时间的延长,发酵藜麦中GABA 含量增加,在发酵时间为18 h 时,GABA 含量达到了2.18 mg/g,是发酵前藜麦（ck2）的1.27 倍,是原藜麦（ck1）的5.28 倍。造成试验现象的原因可能是发酵时间过长,积累的GABA 转化形成其他物质,从而导致含量下降。因此接种乳酸菌后发酵时间为18 h 左右较为合适。

2.9 发酵条件正交优化

在乳酸菌发酵单因素基础上,进行三因素三水平正交优化试验,结果见表5、表6。

表5 发酵工艺正交优化Table 5 Orthogonal optimization of fermentation process

表6 发酵工艺正交试验方差分析Table 6 Variance analysis of fermentation process orthogonal experiment

通过表5、表6 可知,3 个因素影响藜麦发酵富集GABA 的次序为G>E>F,即发酵时间>接种量>发酵温度,其中发酵时间对发酵效果有显著性影响。直观分析显示,其最佳组合为E2F1G3,但试验组中以E2F1G2效果最好,分别对该两组工艺进行对比验证,结果显示,采用工艺组合E2F1G2发酵藜麦所富集的GABA 达（2.45±0.01）mg/g,含量较高,是发酵前藜麦（ck2）的1.43 倍,是原藜麦的5.92 倍,故确定组合E2F1G2为最佳发酵工艺,即接种量为2.0%,发酵温度为32 ℃,发酵时间为18 h。

3 结论

为提高藜麦的营养价值,以藜麦为原料,采用低温胁迫方式对藜麦种子进行冷处理后培养使其萌发,结果表明,藜麦种子在合适低温环境中进行一定时间的冷处理,对藜麦种子萌发具有促进作用,萌发后种子中GABA 含量比未处理组高；将发芽藜麦进行乳酸菌发酵处理,发酵后GABA 含量有较大幅度的提高,说明乳酸菌发酵能够进一步提高藜麦GABA 含量。综上表明,低温胁迫联合乳酸菌发酵对提高藜麦种子GABA 含量有一定的效果,后期将对藜麦种子在低温胁迫过程中内源激素、内酶等物质活性的变化规律以及乳酸菌发酵过程中GABA 合成转化规律进行深入研究。