板枣发酵酒的生产工艺优化及体外消化

汪江波，薛超越，朱嘉璐，何 超，沈 艳，蔡凤娇，张瑞景，徐 健,*

（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，工业发酵省部共建协同创新中心，发酵工程教育部重点实验室，工业微生物湖北省重点实验室，湖北武汉 430068；2.湖北毕圣泉酒业有限公司，湖北黄冈 438700；3.浙江兴业集团有限公司，浙江舟山 316100）

板枣生产于山西省运城市稷山县，是当地一种特色的支柱产业，属于山西的四大名枣之一，果实呈紫红色，果肉呈白绿色，口感甘甜，有天然的芬芳香味，含糖丰富，烘烤过后可以拉出金黄的细丝，维生素和矿物质是所有枣类中含量最高的，被称为“中华枣中之王”[1]。板枣的主要生物活性成分是维生素C、酚类、类黄酮、三萜酸和多糖[2]。枣果有抗癌、抗炎、抗肥胖、免疫刺激、抗氧化、保肝、胃肠保护活性以及抑制巨噬细胞中泡沫细胞的形成等作用，为高级补品，药用价值极高[3-4]。

作为当地农民增收的主要来源，稷山板枣容易受天气影响，生产出裂果、小果，缺乏产品商业价值，且目前市场上红枣发酵酒匮乏，人工配制红枣酒基本垄断了红枣酒的市场。人工配制酒香气不足、口感欠佳且北方许多枣酒厂的生产工艺不能反映枣酒本身的特性，缺乏典型性，将板枣进行深加工，同时目前板枣发酵酒多以单原料进行发酵，通过添加辅料例如：青苹果，山楂，橘子等，不仅可以提高板枣酒的酸度，又可以生产出香气丰富的板枣酿造酒，提高板枣商业价值[5-6]。板枣酒在发酵过程中总酚含量，抗氧化活性均有所提高，但对于其进入人体后在胃和肠道消化过程中的变化情况却少有研究。本实验通过体外消化模拟人体消化时的生理条件，对板枣酒进入人体后进行胃消化模拟和肠消化模拟，研究摄入物质的变化、相互作用以及营养物质生物可及性。

本研究采用板枣发酵制作果酒。以酸度和感官评价为指标，对辅料的选择进行单因素实验，以感官评价为指标，选择对影响酿酒生产的3 个因素（物料比，发酵温度，浸提温度）进行Box-Behnkn 试验设计，随后进行神经网络模拟与遗传算法优化板枣酒的发酵工艺参数，并对其进行体外消化分析，以期为后续的板枣发酵酒提供借鉴和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

板枣（干枣）、青苹果、山楂、橘子 市购；果胶酶（500 U/mg）安琪酵母股份有限公司；SO2分析纯，上海国药集团有限公司；安琪果酒专用酿酒酵母 安琪酵母股份有限公司；胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（1:250）、猪胆盐 美国Sigma 公司。

VWR UV-1600PC 紫外可见分光光度计 美国VWR 公司；MJP-250 恒温培养箱 上海精宏设备有限公司；JJ-2B 组织捣碎机 方科仪器（常州）有限公司；TGL-16M 立式冷冻离心机 常州市金坛高科仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 板枣酒发酵工艺 板枣→筛选→清洗→浸提→加辅料→打浆→板枣枣浆→酶解→冷却待用→添加二氧化硫→添加酵母→发酵→过滤→澄清→枣酒

参照杨智刚[7]的方法，将板枣洗净破碎，放入50 ℃、500 mL 锥形瓶用纯水水浴浸提2 h，山楂洗净与板枣混合打浆，加入40 mg/L 果胶酶酶解1 h，添加50 mg/L 二氧化硫灭菌10 h，添加200 mg/L 已活化酿酒酵母（酵母活化：将10 g 酵母、90 mL 纯水、1 g 葡萄糖混合加入250 mL 锥形瓶中30 ℃水浴加热30 min），发酵结束后放入500 mL 蓝盖瓶中80 ℃密闭加热1 h 进行灭菌（灭菌方式的选择进行预实验：采用75 ℃、2 h 和80 ℃、1 h，进行感官验证后发现后者香味损失最小，且灭菌时间小于1 h 会造成杂菌污染，灭菌时间过长会造成香味损失），过滤离心得到枣酒。

1.2.2 辅料的选择 将板枣与辅料（青苹果、山楂、橘子）以3:1（w/w）的比例分别混合并制成相应的枣浆，然后按照1.2.1 工艺流程进行发酵，测定其酸度，并进行感官评价。

1.2.3 板枣果酒发酵工艺优化单因素实验设计 通过预实验选择了对实验结果影响最大的3 个因素：浸提温度、物料比、发酵温度。理化指标的检测有6 项：酒精度、总酸、发酵时间、DPPH 自由基清除率、总酚、总黄酮。不同的单因素对理化指标的影响程度不同，选择对其影响程度最大的几个理化指标作为最终指标。

1.2.3.1 浸提温度的确定 板枣清洗筛选后放入25、50、75、97 ℃温水中浸提2 h，其他按1.2.1 操作，以DPPH 自由基清除率和总黄酮作为指标，确定浸提温度。

1.2.3.2 物料比的确定 在板枣浸提过后，按板枣与山楂比例为1:1、2:1、3:1、4:1（w/w）添加辅料，使板枣与辅料的总量保持在130 g，加入325 g 水混匀打浆，接下来按1.2.1 到发酵结束（发酵结束指标：发酵过程中连续2 d 重量差不超过0.5 g），以总酸、酒精度和感官评分作为指标，确定辅料添加量。

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1.2.3.3 发酵温度的确定 添加酵母后将枣浆放入20、25、30、35 ℃恒温培养箱，其他按1.2.1 操作，以发酵时间和抗氧化活性作为指标，确定发酵温度。

1.2.4 发酵优化Box-Behnkn 试验设计 通过单因素实验，在其分析结果的基础上选择辅料添加量，发酵温度，浸提温度为自变量，感官评价为响应值，优化枣酒发酵条件。试验因素水平如表1 所示。

表1 发酵条件优化Box-Behnken 试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test design for optimization of fermentation conditions

1.2.5 神经网络实验设计 参考Wang 等[8]的方法，利用Matlab 2016a 软件对Box-Behnken 试验结果进行BP 神经网络分析。将BB 实验结果分为12 个训练组和5 个验证组，训练过程进行1000 次，直到预测值与实际输出结果之间的均方误差（MSE）小于10-3，最后运用遗传算法对BP 神经网络分析得到的模型进行最优值求解。

1.2.6 理化指标测定 酸度和总糖采用GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的直接滴定法和指示剂法；酒精度采用GB 5009.225-2016《食品安全国家标准 酒中乙醇浓度的测定》中的酒精计法；总酚采用Folin-Ciocalteu 酚法[9]，测定总多酚含量；总黄酮参照靳玉红等[10]的方法，测定总黄酮含量。

DPPH 自由基清除能力参照唐兰芳等[11]的方法：配制100 μmol/L 的DPPH 甲醇溶液，准确吸取稀释50 倍后的0.5 mL 样品溶液与3.0 mL DPPH溶液混合，摇匀，室温避光反应30 min，采用分光光度计在波长517 nm 处测其吸光度值OD样品。对照组以0.5 mL 甲醇溶液代替样品，测其吸光度值OD空白，计算DPPH 自由基清除率按式（1）计算：

式中，OD空白：甲醇溶液与DPPH 溶液混合液的吸光度；OD样品：样品溶液与DPPH 溶液混合液的吸光度。

ABTS＋自由基清除率测定：ABTS 母液的配制：将245 μL（100 mmol/L）过硫酸钾溶液和9.5 mL 7 mmol/L ABTS 溶液混合于10 mL 容量瓶中，然后用纯水定容并混合均匀，置于黑色瓶子中并用牛皮纸包裹于黑暗中静置15 h。使用时用无水乙醇对母液进行稀释，使其在734 nm 波长处的吸光度为0.7±0.02，即得ABTS 工作液。取1 mL 板枣酒消化液加入5 mL ABTS 溶液，室温避光反应7 min 后在734 nm 波长处测吸光度；以1 mL 蒸馏水代替消化液测其吸光度作为空白对照。每组样品平行3 次，按式（2）计算ABTS+自由基清除率：

式中，OD空白为空白对照的吸光度；OD样品为样品的吸光度。

1.2.7 感官指标评价方法 依据GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》和相关研究确定板枣发酵酒的感官评价标准，满分100 分（见表2）。选择5 名专业品酒师进行感官评价[12-13]。

表2 板枣发酵酒感官评分标准Table 2 Sensory scoring standard of chinese jujube fermented wine

1.2.8 体外消化实验设计 体外模拟消化模型参考Brodkorb 等[9]的方法进行。

胃消化模拟液（SGF）：0.69 mL KCl、0.09 mL KH2PO4、1.25 mL NaHCO3、1.18 mL NaCl、0.04 mL MgCl2、0.05 mL（NH4）2CO3、36.7 mL 水。

肠消化模拟液（SIF）：0.68 mL KCl、0.08 mL KH2PO4、4.25 mL NaHCO3、0.96 mL NaCl、0.11 mL MgCl2、33.92 mL 水。

胃消化模拟：将11.25 mL 的SGF 溶液与15 mL样品混合，加入0.75 mg 胃蛋白酶（1:3000）和0.5 mL HCL 溶液并将pH 调整为2，并在37 ℃下预热15 min。后在37 ℃厌氧避光环境下振荡孵育2 h，消化过程中每隔20 min 取样。

肠消化模拟：在胃消化液的混合物中取15 mL样品加入8.25mg SIF、3.75 mL 胰蛋白酶（20 mg/L）和1.875 mg 猪胆盐（0.15 mg/L）混合溶液，并使用NaHCO3（1 mol/L）将混合后消化物pH 调节至7.5，后在37 ℃厌氧避光环境下振荡孵育2 h，消化过程中每隔20 min 取样。

所取消化混合物样品以8000×g 离心15 min，取上清液并立即置于-20 ℃冰箱中，后续测定胃肠道消化过程中板枣枣浆的多酚含量，DPPH 自由基清除率和ABTS＋自由基清除率。

1.3 数据处理

本研究中所有实验和检测均重复进行三次，数值以平均值±SD 表示。采用IBM SPSS 25.0 版统计软件对数据进行显著性分析，P<0.05 认为数值间存在显著性。使用Origin 2021b（OriginLab，USA）进行数据绘图。

2 结果与分析

2.1 辅料的筛选

添加辅料的目的是增加枣酒的酸度，酸含量显著影响果酒的口感，使其具有清爽的特性，减少可感知的甜度，适当的低pH 对于果酒的颜色稳定性至关重要，它还可以防止酚类化合物的氧化，果酒的高酸度也有抑菌作用[14]。从表3 可知，添加山楂的枣酒酸度为4.92 g/L，是发酵果酒比较适口的酸度水平，同时感官评分最高为74.52 分。而添加青苹果的板枣发酵酒的酸度为3.51 g/L，酸度太低，水味较重，感官评分也比较低为65.13 分，添加橘子的板枣发酵酒的酸度为7.32 g/L，酸度太高，入口不适，感官评分为68.21 分。综上所述，选择山楂作为板枣发酵酒的辅料添加。

表3 辅料对枣酒酸度和感官评分的影响Table 3 Effects of ingredients on acidity and sensory score of jujube wine

2.2 板枣酒发酵工艺优化单因素实验

2.2.1 浸提温度对板枣酒发酵的影响 由图1 可知，随着浸提温度的上升，DPPH 自由基清除率呈现先上升后下降的趋势，浸提温度为75 ℃时，DPPH 自由基清除率出现显著下降；由图2 可知，随着浸提温度的上升，总黄酮含量出现先上升后下降的趋势，当浸提温度为50 ℃时，DPPH 自由基清除率最高，总黄酮含量最高。这是由于温度升高可以加速分子间的运动，提高扩散系数，从而降低了溶剂的粘度，最终加速总黄酮的溶出[15]；温度升高的同时也加速了细胞壁的软化和破坏，增加了细胞膜的通透性，导致总黄酮的溶出增加[16]。但是在高温下，黄酮受热不稳定而分解，或者由于黄酮类物质在高温条件下易被氧化，部分黄酮类物质结构发生改变，从而使黄酮得率下将[17]，黄酮类化合物具有共轭双键结构，其在高温下容易失去活性，对O2-·的清除能力降低，导致DPPH自由基清除率下降，抗氧化活性降低[17]。因此最终选择浸提温度为50 ℃为最佳萃取条件。

图1 浸提温度对板枣酒DPPH 自由基清除率的影响Fig.1 Effects of extraction temperature on DPPH free radical scavenging rate of jujube wine

图2 浸提温度对板枣酒总黄酮的影响Fig.2 Effects of extraction temperature on total flavonoids of jujube wine

2.2.2 物料比对板枣酒发酵的影响 板枣与山楂的比例会对板枣酒的酒精度和酸度有一定影响，山楂果总糖含量是96.45 g/kg，总酸含量是35.13 g/kg，而板枣的总糖含量是223.65 g/kg，因此随着山楂添加比例的增加，板枣发酵酒的酒精度就会升高。由图3可知，随着山楂添加比例的减少，酒精度由4.7%vol提升到10.2%vol，而过低的酒精度会造成酒体香气不足，口感寡淡[18]。由图4 可知，随着山楂添加量的减少，枣酒总酸也在不断减少，但是过高的酸度也会降低枣酒的口感[19]，因此采用感官评价为指标探究山楂添加量对枣酒的影响，由表4 可知当板枣与山楂的比在3:1 的时候感官评分最高，此时枣酒的酒体达到更好的平衡。

图3 物料比（板枣:山楂）对板枣酒酒精度的影响Fig.3 Effects of material ratio (red date:hawthorn) on alcohol of jujube wine

图4 物料比（板枣:山楂）对板枣酒总酸的影响Fig.4 Effects of material ratio (red date:hawthorn) on total acid of jujube wine

表4 山楂添加量对感官评分的影响Table 4 Effects of hawthorn addition on sensory score

2.2.3 发酵温度对板枣酒发酵的影响 发酵温度对板枣酒的发酵时间有一定影响，适当提高发酵温度可以减少发酵时间，且温度对酒体感官评价影响较小。由图5 可知，随着发酵温度的增加，发酵时间由11 d缩短到5 d，且发酵温度达到30 ℃时发酵结束时间最短，随着温度的继续增高，发酵过程中的失重总量减少，得到的酒体酒精度降低，酒体香气不足。这是由于当发酵温度较低时，酿酒酵母活性同时降低，其生长繁殖速度较慢，进而使发酵周期延长；随着温度的升高，微生物生长繁殖速度加快，但是过高的发酵温度会使发酵反应剧烈，酵母衰老速度加快，酒体的风味挥发加快，且高温条件下可能使腐败微生物加快发育，最终导致板枣酒品质下降，发酵不充分，果酒香味不足，酒精度降低[20]。由图6 可知发酵温度为30 ℃时DPPH 自由基清除率最高，这是由于温度是影响微生物生长发育的重要环境因素，在温度升高的过程中，微生物的细胞体内会逐渐产生大量的活性氧自由基，为了抵抗高温胁迫微生物会启动自己体内的抗氧化系统来消耗自由基；但是过高的温度会抑制抗氧化酶的分泌[21-22]，因此枣酒的DPPH 自由基清除率在30 ℃时达到最高。综上所述选择发酵温度为30 ℃。

图5 发酵温度对板枣酒发酵时间的影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on fermentation time of jujube wine

图6 发酵温度对板枣酒DPPH 自由基清除率的影响Fig.6 Effect of fermentation temperature on DPPH radical scavenging rate of jujube wine

2.3 枣酒发酵工艺优化试验

2.3.1 神经网络模拟与遗传算法优化发酵工艺 通过单因素实验，选择物料比、发酵温度、浸提温度为自变量，感官评价为响应值，优化枣酒发酵条件。试验结果见表1 和表5 所示。

表5 Box-Behnkn 优化发酵工艺试验结果Table 5 Experimental results of Box-Behnkn optimized fermentation

采用Box-Behnkn 试验来研究不同发酵条件与枣酒感官评价之间的相互作用，共17 组试验如表5 所示。Box-Behnkn 试验的前12 组数据作为训练组，后5 组数据作为测试组，隐藏层采用“3-11-1”的拓扑结构进行神经网络训练[23]，进行1000 次实验，训练过程进行101 次后预测值与实际输出结果之间的均方误差（MSE）小于10-3。此时样本点集中分布在y=x 直线附近，R=0.99686，说明训练值与预测值接近，且具有较好的线性关系，神经网络训练结果良好，可用于预测。将训练好的神经网络模型导入遗传算法，得到一个更优的板枣发酵的工艺参数：板枣添加量:山楂添加量为2.96:1，发酵温度29.07 ℃，浸提温度45.34 ℃，该发酵条件下获得的枣酒感官评价为82.52 分。为验证预测结果的可靠性，需进行发酵实验来验证。

2.3.2 发酵验证 为了验证神经网络模拟与遗传算法优化枣酒发酵工艺的可行性，采用最佳发酵条件进行枣酒发酵的验证实验，结合实际生产情况以板枣与山楂的比例为2.96:1，发酵温度29 ℃，浸提温度45 ℃为发酵条件进行3 次平行实验，得到实验结果如表6 所示，实际测得的山楂板枣酒的感官平均评分为81.66，实验符合值为98.95%。符合DB65/T 2977-2009 果酒生产标准体系总则。

表6 发酵验证实验理化指标Table 6 Physical and chemical indexes of fermentation validation experiment

2.4 体外消化实验

在模拟人体消化系统中，分析了板枣枣浆和板枣酒中酚类化合物含量、抗氧化活性在消化过程中的变化。多酚对果酒的质量有显著影响，因为这些物质会影响果酒的感官特征，如颜色、涩味和抗氧化性能[24]。由图7A 可知，板枣枣浆经发酵后得到的板枣酒可产生更多的酚类物质，且在胃消化过程中板枣酒的多酚含量始终高于板枣枣浆，这可能是由于在浸提过程中板枣果皮和果实上的多酚类物质被释放到酒体中[24]，同时在发酵的过程中，酵母菌会产生有机酸等副产物，这些物质会降低酒体的pH，从而防止酚类化合物的氧化，增加多酚类物质的释放[14]。在模拟胃消化的过程中，板枣枣浆和板枣发酵酒的多酚含量都有所增加，分别增加了17.62%和16.19%，这可能是由于在胃消化过程中高分子多酚向解聚转变，以产生大量的酚酸[25]。且由于胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用，一些蛋白质会被分解释放出与多酚类物质结合的多肽和氨基酸。这些多肽和氨基酸可以与多酚类物质结合，形成新的复合物[26]，这些多酚衍生物将活性官能团释放到与福林-Ciocalteu 试剂配合物中，使总酚值明显增加。DPPH 自由基清除率和ABTS＋自由基清除率都是用来评估化合物抗氧化能力的指标，清除率越高，物质的抗氧化能力越强。由图7B～图7C 可知，在胃消化过程中板枣枣浆和板枣发酵酒的抗氧化能力都有所增加，板枣枣浆的DPPH 自由基清除率和ABTS＋自由基清除率分别增加了31.15%和17.47%，板枣发酵酒的DPPH 自由基清除率和ABTS＋自由基清除率分别增加了22.15%和13.09%。这是由于物质的抗氧化能力与其酚类物质含量有较高相关性[27]，因此在消化过程中随着酚类物质含量的提高，酒体的抗氧化活性也随之升高。同时在模拟胃消化过程中胃酸有利于多酚物质的释放，从而更好地发挥其抗氧化能力[28]。

图7 胃消化对板枣酒多酚含量（A）、DPPH 自由基清除率（B）、ABTS＋自由基清除率（C）的影响Fig.7 Effects of gastric digestion on polyphenol content (A),DPPH free radical clearance rate (B),and ABTS+ free radical clearance rate (C) of jujube wine

由图8 可知，在肠消化过程中板枣枣浆的多酚含量，DPPH 自由基清除率和ABTS＋自由基清除率分别增加了35.42%、35.91%和111.45%，板枣发酵酒的酚含量，DPPH 自由基清除率和ABTS＋自由基清除率分别增加了42.06%、22.31%和85.80%。这是由于在肠发酵过程中pH 改善了多酚在小肠中的降解[29]。其次，在小肠中酚类的氧化和聚合产生新的酚类副产物。最后，由于胰酶和胆汁作用，使蛋白质与多酚之间的共价键断裂，释放出更多的自由酚类物质[30]。由图8C 可知，在肠消化过程中板枣枣浆和板枣发酵酒的ABTS＋自由基清除率都有显著提升，分别增加了111.45%和85.80%。这可能是由于多酚类化合物ABTS＋自由基清除率呈pH 依赖性，随着pH 的增高，自由基清除能力变强，这与多酚化合物芳香环酚性羟基在弱碱性pH 环境下去质子化有关[31]。

图8 肠消化对板枣酒多酚含量（A）、DPPH 自由基清除率（B）、ABTS＋自由基清除率（C）的影响Fig.8 Effects of intestines digestion on polyphenol content (A),DPPH free radical clearance rate (B),and ABTS+ free radical clearance rate (C) of jujube wine

3 结论

本实验对板枣酒的发酵工艺进行了研究，以板枣为原料，添加山楂辅料进行板枣酒的发酵。在单因素实验的基础上，通过神经网络模拟与遗传算法并结合实际生产条件最终确定了最佳工艺条件：板枣与山楂的比例为2.96:1（w/w），发酵温度29 ℃，浸提温度45 ℃。在此条件下，得到的枣酒酒精度为9.52%vol，总酸为4.89 g/L，总黄酮1023 mg/L，总酚1056 mg/L，稀释50 倍条件下DPPH 自由基清除率为55%，酒液澄清，色泽棕黄，香气协调诱人。进行体外消化研究分析发现板枣枣浆和板枣酒经过消化后总酚含量和抗氧化活性均有所提高。结果表明经体外消化后板枣枣浆和板枣酒在酶和胆汁的作用下总多酚、总黄酮得到充分释放、整体抗氧化能力得到提高。本研究结果为枣酒发酵工艺提供了数据积累，对板枣资源的综合利用有一定的积极意义，有利于枣酒产品的进一步研发。

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