基于网络药理学探讨桑白皮-夏枯草治疗原发性高血压的作用机制*

祝昕杰 张世亮 马月香 李昱静 玄霄宇

原发性高血压(Essential hypertension)又称高血压病(HBP),其重要表现是平均血压增加,是心脑血管疾病的危险因素,与其他危险因素并存,可损伤心、脑、肾的结构和功能,甚至导致严重后果及器官功能衰竭[1]。高血压病是导致残疾和死亡的首要危险因素,甚至比吸烟和高血糖等更严重[2]。降压药物、运动和减重等方法可达到降压目的,但仍有部分患者血压控制效果不尽如人意[3]。

桑白皮[4]药用历史悠久,可追溯到《神农本草经》。该药味甘、性寒,归肺经,具有泻肺平喘、利水消肿的功效,用于医治肺热喘咳、颜面浮肿、小便不利等症状[5]。研究表明,桑白皮不仅有平喘、镇咳、祛痰、利尿等药效,还具有扩张毛细血管、抗炎、镇痛、抗氧化、抗过敏、降血糖、免疫调节等诸多药理作用[6]。夏枯草性味辛、苦、寒,有助于清肝泻火、明目、散结消肿,可用于治疗头痛眩晕、目赤肿痛、目珠夜痛等[7]。药理学表明,夏枯草还含有明显降血压、降低血糖、抗氧化、抗炎、免疫调节等功用[8]。

网络药理学联通了药物、成分、靶点,将其复杂的关系通过网络简单化、可视化,分析各节点的关系,进而阐释中药对疾病的作用机制,搭建了中医药与现代药理学的桥梁,为中医药的研究提供了平台[9],其系统性和整体性特征符合中医整体观念,从系统和网络的角度认识了疾病与生物学的关系。本研究借助网络药理学,以桑白皮-夏枯草药对为例,阐释中医药治疗原发性高血压的作用机制,为进一步研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 桑白皮夏枯草潜在有效化合物的获取与靶标的筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)中搜索桑白皮、夏枯草,在项目栏中,选择类药性(DL)≥0.18且口服生物利用度(OB)≥30%的成分,其余成分不需要经过过滤。导出筛选后的成分及其对应的所有靶标。将靶标数据导入全球蛋白质资源数据库(UniProt,http://www.uniprot.org),翻译成对应的人类基因简称,移除非人源的靶标,便于后续的分析和处理。

1.2 HBP疾病相关靶标预测访问基因卡片数据库(GeneCards,http://www.genecards.org),以“essential hypertension”为关键词检索,得到HBP相关靶标。

1.3 桑白皮-夏枯草与高血压病靶标PPI网络构建将桑白皮和夏枯草的靶标合并去除重复项,与疾病的靶标取交集,在生物分子功能注释系统(STRING 11.5,http://string-db.org)中,限定Multiple proteins模式,勾选物种Homo sapiens,构建药物与疾病的蛋白相互作用(PPI)网络模型,将其输入Cytoscape 3.9.1,利用该软件中的Centiscape插件进行滤过,选择介数(Betweenness)、密切度(Closeness)、连接度(Degree)作为分析条目,从而确定药对治疗HBP的核心靶标。

1.4 核心靶标的GO功能和KEGG通路富分析将上一步得到的核心靶标录入David功能注释网站(http://david.ncifcrf.gov),通过对“Homo sapiens”物种的生命功能和通路进行富集研究,利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)的在线绘图技术,将富集结果可视化。

1.5 成分-靶标-通路网络构建将药物成分、核心靶标和前20条通路整合到Excel文件中,并将其上传至Cytoscape 3.9.1软件,利用软件中的Analyze Network功能,对网络拓扑中每个节点的参数加以解析,以确定药物的主要药效成分、核心靶标和关键路径,最终构建出成分-靶标-通路的网络图。

2 结果

2.1 桑白皮-夏枯草潜在有效活性成分及靶标的获取在TCMSP中,桑白皮和夏枯草的化学成分分别为194种和60种,经过筛选,桑白皮有效成分31种,夏枯草有效成分11种,2种药物有3个共同成分,经过重复值删除后,最终确定了39种有效活性成分,包括槲皮素(Quercetin)、山萘酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)等。桑白皮有6个成分无对应靶标,剩余25个成分对应195个作用靶标;夏枯草11个成分对应211个作用靶标,最终并集靶标218个。

2.2 HBP疾病相关靶标的预测在GeneCards中,发现了7964个与HBP相关的靶标。

2.3 PPI网络构建及核心作用靶标筛选将疾病与药物靶标进行映射,得到了194个共同靶标。使用STRING构建共同靶标的蛋白互作网络图,共获得194个节点,3716条边,平均节点度值为38.3。通过使用Cytoscape及Centiscape插件滤过得到41个核心作用靶标。其中,前5位靶标是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、细胞肿瘤抗原P53(TP53)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)、人原癌基因c-Jun(JUN)。

2.4 GO功能与KEGG富集分析应用David数据平台,对核心靶标进行分析,获得其所参与的功能及通路。于微生信平台绘制BP、CC、MF、KEGG气泡图。见图1。

图1 BP CC MF KEGG气泡图

GO分析显示桑白皮-夏枯草治疗高血压病涉及454个生物过程,KEGG通路富集分析显示143条通路,癌症通路(Pathways in cancer)与高血压病密切相关,其次是糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、膀胱癌(Bladder cancer)、脂质和动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)等。

2.5 药物成分-靶标-通路网络构建从Cytoscape构建“中药成分-靶标-通路”网络图,并从中分析选取到9个关键药物成分,41个核心作用靶标,9条重要富集通路。

3 讨论

高血压病是西医学病名,症状主要为头晕、头痛、心悸、颈项板紧、疲劳等[10],与中医学的“眩晕、头痛”类似[11]。《黄帝内经》曾提到:“诸风掉眩,皆属于肝”,指眩晕属风,为肝之变。夏枯草归肝经,可清泄肝经郁火,治疗肝火上炎或肝阳上亢的头痛眩晕、目赤肿痛等;桑白皮清肝降压,治疗水肿胀满尿少、肝阳肝火偏旺之高血压病[7]。二药合用,平肝阳,泻肝火,消水肿,缓解眩晕[7]。

该过程涉及多种药物成分,有研究证实槲皮素有显著降压效果,可作用于心血管系统,机制为抑制收缩反应、改善血管内皮依赖性松弛[12]。此外,槲皮素可以下调TLR4/NF-kB信号通路,保护实验大鼠血管内皮功能,降低自发高血压病大鼠的血压值[13,14]。山萘酚有着与槲皮素相似的生化构成,在预防心血管疾病、降血糖、抗炎、抗氧化、缓解骨质疏松等方面有较高的药用价值,临床上已广泛用于治疗心脑血管疾病和胃癌[15]。山萘酚还可下调MAPK通路,逆转内皮损伤及其炎症反应[16],增强内皮依赖性血管舒张功能,其通过舒张血管,起到降压作用[17]。研究证明,β-谷甾醇有类似于氢化可的松和强的松等较强抗炎作用,豆甾醇也有一定消炎功能,且均无可的松类药物的不良作用,因此能够当作辅助抗炎症药物持续使用,而且还具备近似于阿司匹林类的退热镇痛效果[18]。β-谷甾醇还具备多种药理活性,包括抗炎、镇痛、降低血脂和抗肿瘤等[19]。药对中各化学成分间存在相互关系,在治疗中共同发挥作用。

PPI网络各靶标间也呈现出密切而复杂的联系。苗艳菊等[20]研究发现AKT1 mRNA蛋白的表达与活化参与高血压病心肌纤维化的发展。TP53是一种抑癌基因,其与细胞的增殖和恶变有关,并且可能与高血压病左心室肥厚及动脉硬化有关[21]。TNF会使体内ET-1等缩血管物质分泌增多、NO等血管舒张因子减少,进而引发小动脉痉挛,使血压升高[22]。王海蓉等[23]指出TNF-α、IL-6水平升高后会增加高血压病及心血管不良事件的发生。炎症过程中IL-6的低甲基化也与高血压病密切相关[24]。郭光明等[25]指出C-JUN蛋白在肿瘤细胞中发挥双向作用,促进细胞增殖和细胞凋亡双向调节。PPI网络错综复杂,也充分说明该药对治疗HBP多途径、多靶标的复杂方式。

经过GO和KEGG分析,癌症通路涉及关键靶标31个,在高血压病治疗中起到关键作用。AGE与RAGE相互作用,促使血管平滑肌细胞增生,进而诱导血管肥厚,产生肺动脉高压[26]。较高的血流剪切力可以维持血管内皮的正常功能,减少内皮损伤因子的分泌,保护血管内膜,有效预防高血压病的发生[27]。由此,中药治疗高血压病也得到更加充分、多元的印证。

综上所述,本研究从网络药理学角度初步揭示了桑白皮-夏枯草药对治疗HBP的理论,其通过多种成分、大量靶标、数种功能与信号通路协同发挥作用,这些发现为临床治疗HBP提供依据,并为进一步研究奠定基础。但本研究是基于网络药理学的理论性探索,其机制仍有待进一步试验的考察和验证。