十溴联苯醚灌胃后小鼠宫颈癌皮下移植瘤组织肿瘤相关成纤维细胞标志基因表达变化及其意义

陈楠，李榕，祖尼热·吐尔逊，刘早玲

新疆医科大学公共卫生学院，乌鲁木齐 830000

多溴联苯醚（PBDEs）是一种常作为阻燃剂添加到塑料、电子产品、纺织品中的环境内分泌干扰物（EDCs），可诱导上皮—间质转化、内质网应激、氧化应激等，从而促进肿瘤进展［1］。十溴联苯醚（BDE-209）是PBDEs同系物中的一员，曾因性能优越而被广泛量产，可在多种情况下发生脱溴反应转化为毒性更高的低溴代联苯醚，已被证实有生殖毒性和致癌性［2-4］。但目前尚缺乏BDE-209对宫颈癌实体瘤组织影响的相关研究。宫颈癌组织由肿瘤细胞及其所在的免疫和基质环境组成，称为肿瘤微环境（TME）。TME是一种酸性、缺氧和免疫抑制的生物环境，肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）是TME基质细胞的主要组成部分，不仅来源广泛（如通过上皮—间质转化、骨髓间充质干细胞等分化为CAFs），还可通过分泌免疫调节分子、与免疫细胞相互作用和重塑细胞外基质（ECM）等，促进肿瘤细胞增殖和免疫逃逸，对肿瘤的发生发展至关重要［5-6］。2022年3月—2023年12月，本研究通过皮下注射宫颈癌U14细胞建立小鼠宫颈癌皮下移植瘤模型，并以不同剂量BDE-209进行经口灌胃干预，筛选宫颈癌皮下移植瘤组织CAFs标志差异表达基因，旨在探讨BDE-209暴露对宫颈癌肿瘤微环境中CAFs的影响，为深入探讨BDE-209对宫颈癌的致癌作用提供参考依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：SPF级雌性C57BL/6小鼠40只，4～6周龄，体质量14～16 g，购自新疆医科大学北校区动物实验中心。细胞：宫颈癌U14细胞购自上海赛百慷生物技术股份有限公司，使用DMEM高糖完全培养基（含10%胎牛血清，1%双抗），置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。主要试剂：BDE-209购自上海源叶生物科技有限公司，TransZol Up Plus RNA Kit购自北京全式金生物技术有限公司，Prime-ScriptTMRT reagent Kit、TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ购自日本TaKaRa公司。主要仪器：HC-3018R高速冷冻离心机购自安徽中科中佳科学仪器有限公司，恒温培养箱购自上海双旭电子有限公司，单道手动移液器购自德国Eppendorf公司，荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 小鼠宫颈癌皮下移植瘤模型建立及BDE-209灌胃处理 取对数生长期的宫颈癌U14细胞，以生理盐水制成细胞悬液，调整细胞密度为2 × 107/mL。40只雌性C57BL/6小鼠适应性喂养1周，随机分为对照组、BDE-209低剂量组、BDE-209中剂量组、BDE-209高剂量组，每组10只。各组小鼠均于右前腋下接种宫颈癌U14细胞悬液0.1 mL，接种后每日观察皮下肿瘤生长情况，接种第5天右前腋下有米粒大小肿瘤提示成功建立小鼠宫颈癌皮下移植瘤模型。将BDE-209粉末溶解于玉米油中，BDE-209低剂量组、BDE-209中剂量组、BDE-209高剂量组小鼠建模成功后分别经口灌胃给予20、100、500 mg/kg BDE-209，对照组给予等体积玉米油，连续21 d。

1.3 移植瘤组织差异表达基因筛选 各组灌胃结束后，次日采用颈椎脱臼法处死，完整剥离皮下移植瘤，立即放入液氮中冷冻保存。对移植瘤组织进行转录组测序，每组3个样本。转录组测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成操作，包括RNA提取及质量检测、基因文库构建、上机测序及数据质量评估等。以对照组为参照，使用R4.2.1软件的Deseq2 R包分析转录组测序数据，以Padj ＜ 0.05、|logFC| ≥ 1为标准，筛选与对照组相比BDE-209高、中、低剂量组的差异表达基因。

1.4 CAFs标志差异表达基因筛选 通过查阅文献得到小鼠CAFs标志基因［7-9］，使用VennDiagram R包将CAFs标志基因与“1.3”得到的BDE-209高、中、低剂量组差异表达基因取交集，获得CAFs标志差异表达基因，并通过Heatmap R包将其在各样本中的表达情况进行可视化。

1.5 CAFs标志差异表达基因相关功能及通路分析 将CAFs标志差异表达基因上传至Metascape在线网站（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），进行基因本体论（GO）功能和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

1.6 CAFs标志差异核心基因筛选 利用String数据库（https：//cn.string-db.org/）构建CAFs标志差异表达基因的蛋白质相互作用网络（PPI）图，使用Cytoscape软件（版本v3.9.0）的cytoNCA插件，采用Betweenness算法确定排名前十的CAFs标志差异表达基因，并进行可视化，即为CAFs标志差异核心基因。

1.7 移植瘤组织CAFs标志差异核心基因检测 采用实时荧光定量PCR法。取BDE-209高剂量组与对照组小鼠的部分移植瘤组织各5例份，TransZol Up Plus RNA Kit试剂盒提取组织总RNA，Prime-ScriptTMRT reagent Kit逆转录试剂盒说明书将其逆转录为cDNA，TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ试剂进行聚合酶链式反应。PCR反应条件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s（40个循环），每个样本重复3次。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.8 统计学方法 采用SPSS26.0统计软件。计量资料采用S-W法检验正态性，呈正态分布以±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用两独立样本t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠移植瘤组织差异表达基因筛选结果 BDE-209高、中、低剂量组与对照组比较分别有957、24、14个差异基因，其中上调基因分别为816、21、7个，下调基因分别为141、3、7个。因BDE-209中、低剂量组与对照组间差异基因较少，故使用BDE-209高剂量组与对照组间的957个差异基因用于后续分析。

2.2 CAFs标志差异表达基因筛选结果 将122个CAFs标志基因与957个BDE-209高剂量组差异表达基因取交集，得到CAFs标志差异表达基因30个（OSID码图1），其中BDE-209干预后上调29个、下调1个（OSID码图2）。

2.3 CAFs标志差异表达基因富集分析结果 GO功能富集分析结果显示，CAFs标志差异基因主要富集在ECM、生殖结构发育、PI3K/Akt信号转导、对活性氧的反应等，见OSID码图3。KEGG通路富集分析结果显示，CAFs标志差异基因主要富集在补体和凝血级联反应、肿瘤发病途径、蛋白质消化吸收、流体剪切应力与动脉粥样硬化及肿瘤中的蛋白聚糖等代谢通路，见OSID码图4。

2.4 CAFs标志差异核心基因筛选结果 CAFs标志差异基因的PPI图包含30个节点和70条边，见OSID码图5。Betweenness算法筛选出排名前十的CAFs标志差异核心基因分别为核心蛋白聚糖（Dcn）、细胞间黏附分子1（Icam1）、C-X-C基序趋化因子配体12（Cxcl12）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、血小板衍生生长因子受体（Pdgfrb）、Ⅴ型胶原蛋白α2（Col5a2）、补体成分1的子成分1（C1s1）、肝细胞生长因子（Hgf）、补体成分3（C3）、纤溶酶原激活物（Plat），其Betweenness得分分别为123.01、102.73、88.56、65.45、64.33、58.76、47.25、39.71、13.77、12.88分，见OSID码图6。

2.5 BDE-209高剂量组与对照组小鼠移植瘤组织CAFs标志差异核心基因表达比较 与对照组比较，BDE-209高剂量组小鼠癌组织Dcn、Icam1、Cxcl12、MMP-2、Pdgfrb、Col5a2、C1s1、Hgf、C3、Plat mRNA相对表达量均升高（P均＜0.05），Pdgfrb mRNA相对表达量无明显变化（P＞0.05）。见表1。

表1 BDE-209高剂量组与对照组小鼠移植瘤组织10个CAFs标志差异核心基因表达比较［-x ± s/M（P25，P75）］

3 讨论

宫颈癌的发生发展是由人乳头瘤病毒（HPV）持续感染、遗传因素、个人生活习惯、环境因素等共同导致的，近年来EDCs对宫颈癌的影响逐渐引起关注［10］。EDCs是一类能扰乱机体内分泌系统的外源性化学物，可通过干扰多种激素的分泌而引发生殖毒性和诱导多种肿瘤发生［11-13］。BDE-209是一种EDCs，作为添加型溴化阻燃剂被广泛应用，其不与塑料或其他产品形成化学键，易在产品生产、使用或回收过程中释放到环境中，且具有环境持久性和体内蓄积性等特点，故可在于人体多种组织（血清、头发、粪便等）中被检测到［14-15］。研究表明，BDE-209参与调控人类乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌细胞的增殖和凋亡［4］。本课题组前期通过HE染色观察到，BDE-209高剂量组的宫颈癌皮下移植瘤肿瘤细胞大小形态严重不一，部分区域出现坏死，可见BDE-209暴露会影响宫颈癌的肿瘤组织病理改变；进一步探究BDE-209对宫颈癌TME的影响时发现CAFs亦发生了变化。CAFs作为TME中的重要组成成分，可通过影响ECM、与免疫细胞相互作用等多种途径促进肿瘤细胞迁移、侵袭。因此，阐明BDE-209对CAFs的影响可为研究其致癌作用提供依据。

本研究对BDE-209干预后的宫颈癌皮下移植瘤组织进行转录组测序分析，筛选出BDE-209高剂量组与对照组间的差异基因，并通过查阅文献获得小鼠CAFs的标志基因，取交集后得到BDE-209灌胃后发生改变的CAFs标志差异表达基因，其中29个基因上调、1个基因下调；GO功能和KEGG通路富集分析结果表明，CAFs标志差异基因主要集中在ECM、生殖结构发育、PI3K/Akt信号转导、补体和凝血级联反应、肿瘤发病途径等通路。ECM是防止肿瘤迁移侵袭的有效屏障，当肿瘤细胞穿透ECM的基底膜后会向外侵袭转移，导致原位癌发展为浸润癌。CAFs不仅可以分泌基质金属蛋白酶（MMPs）降解ECM，还可以分泌ECM成分层粘连蛋白1，导致ECM重塑，从而促进宫颈癌细胞迁移侵袭［16］。PI3K/Akt信号通路是导致多种疾病发展的经典信号通路，该通路异常激活可影响肿瘤血管生成、调控细胞存活、促进转移等。研究发现，相较于正常成纤维细胞，CAFs能通过激活PI3K/Akt信号通路促进肺癌迁移侵袭［17］；同时被激活的PI3K/Akt信号通路亦能活化CAFs，促进细胞前转移性细胞因子分泌和ECM相关成分在CAFs中的表达［18］。以上结果表明，BDE-209暴露可影响宫颈癌CAFs标志基因表达，这些标志基因改变可能通过重塑ECM及激活PI3K/Akt信号通路等途径促进宫颈癌进展。

本研究通过实时荧光定量PCR检测对CAFs标志差异核心基因的mRNA表达情况进行验证，结果显示与转录组测序的趋势基本一致。研究显示，CAFs在多种肿瘤组织中可通过分泌转化生长因子β（TGF-β）、白细胞介素6（IL-6）等细胞因子，上调MMP-2表达，从而促进肿瘤转移和ECM重塑［19］。TME中的补体系统不仅参与先天免疫，还参与促进肿瘤进展，C3是补体激活的核心成分，可通过C3a/C3aR信号通路调控乳腺癌CAFs功能，本研究中BDE-209干预后的宫颈癌上皮移植瘤组织C3表达亦上调。

综上所述，BDE-209灌胃会导致小鼠宫颈癌移植瘤组织CAFs相关标志基因Dcn、Icam1、Cxcl12、MMP-2、Col5a2、C1s1、Hgf、C3、Plat表达升高，其机制可能与诱导CAFs的ECM改变和激活PI3K/Akt信号通路有关。