基于层次分析-熵权法优选温肺平喘汤的提取工艺△

王博，王瑞，王佳，吴作敏，于晓涛*

1.漯河市中心医院 药学部，河南 漯河 462000；2.河南省中药制剂与加工中医药重点实验室，河南 漯河 462000

近年来，受环境污染及疫情影响，上呼吸道感染疾病高发，抵抗力较弱的幼儿及合并慢性基础疾病的老年人易发展为肺炎[1]。肺炎若未能及时得到控制，转为重症可能会出现呼吸衰竭、休克甚至全身器官衰竭，导致功能障碍等严重并发症[2]。目前，由于细菌耐药性增加、精准的抗病毒药物较少等问题，化学药对肺炎的治疗存在一定的局限性[3]。温肺平喘汤由《伤寒论》中“小青龙汤”加减而来，由丹参、白芍、炙甘草等12 味中药组成，具有散寒化瘀、止咳平喘的功效[4]。方中丹参活血通痹、消痈祛瘀[5]为君药，干姜温肺化饮、回阳通脉[6]为臣药，白芍和营养血[7]为佐药，甘草补脾益气、祛痰止咳[8]为使药。丹参中指标性成分丹酚酸B 能够减轻金黄色葡萄球菌肺炎幼鼠体内炎症状态，降低肺组织炎症水平[9]。迷迭香酸可以有效抑制肺部炎症的活性，对脂多糖（LPS）诱导的肺泡巨噬细胞具有极大的抗炎潜力[10]。白芍中芍药苷可以降低组织氧化应激与炎症水平，改善脓毒症所致的急性肺损伤[11]。甘草中的甘草酸显著减少肺和支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞数量，有效地抑制嗜中性气道炎症，减轻组织病理学肺损伤[12]。甘草苷可剂量依赖性地抑制肺中性粒细胞和巨噬细胞炎症，减轻肺上皮细胞的损伤[13]。

层次分析（AHP）-熵权法（EWM）是一种主、客观相结合确定权重值的方法[14]，一方面根据重要程度和主观经验确定分析对象系数，另一面整理分析实验数据，进行赋值，增加结果的科学性和可信度[15]。本研究以方中药效成分芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸含量和干浸膏得率为评价指标，采用正交设计优选温肺平喘汤的提取工艺，为该方进一步的开发和利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A 型高效液相色谱仪、AUW-120D 型十万分之一天平（日本岛津公司）；Milli-Q 型纯水仪（美国密理博公司）；KQ-300E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；5810R 型低温高速离心机（德国Eppendorf 公司）；98-Ⅰ-CN 型智能恒温数显电加热套（天津泰斯特科技有限公司）；RE-52A 型旋转蒸发仪（上海亚荣科技有限公司）。

1.2 试药

对照品芍药苷（批号：110736-201842，纯度：97.4%）、迷迭香酸（批号：111871-202007，纯度：98.1%）、丹酚酸B（批号：111562-201716，纯度：94.1%）、甘草苷（批号：111610-201607，纯度：93.1%）均购自中国食品药品检定研究院；甘草酸（四川成都曼思特生物公司，批号：MUST-19052407，纯度：99.5%），甲酸、甲醇、乙腈均为色谱纯。

丹参（安徽桐花堂中药饮片有限公司，山东，批号：20200701）；白芍（河南鸿博药业有限公司，安徽，批号：191001）；炙甘草（北京时珍堂药业有限公司，内蒙古，批号：20170301），以上饮片经漯河市中心医院于晓涛副主任中药师鉴定均为正品。

2 方法和结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件 YMC Triart C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），以乙腈（A）-0.1%甲酸（B）为流动相梯度洗脱（0～10 min，10%～12%A；10～25 min，12%A；25～30 min，12%～14%A；30～35 min，14%～19%A；35～45 min，19%A；45～60 min，19%～25%A；60～70 min，25%A；70～80 min，25%～27%A；80～90 min，27%～40%A；90～100 min，40%～50%A；100～105 min，50%A；105～110 min，50%～90%A；110～120 min，90%A）；流速为1.0 mL·min–1；柱温为25 ℃；检测波长：230 nm（芍药苷、甘草苷）、330 nm（迷迭香酸）、286 nm（丹酚酸B）、251 nm（甘草酸）；进样量为10 µL。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B 和甘草酸对照品适量，加甲醇溶解，制成质量浓度分别为1.360 0、0.071 4、0.037 8、0.842 8、0.045 0 mg·mL–1的混合对照品储备液。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取处方量中药，加8倍量水加热回流提取2 次，每次1 h，趁热滤过，合并滤液，浓缩至250 mL，精密吸取浓缩液1 mL，13 000 r·min–1离心10 min（离心半径为18.7 cm），取上清液，即得。按照处方分别称取不含白芍、丹参、甘草的其他药味，加8 倍量水提取2 次，每次1 h，滤过，浓缩至250 mL，精密吸取浓缩液1 mL，13 000 r·min–1离心10 min（离心半径为18.7 cm），取上清液，即得阴性样品溶液，见图1。

图1 温肺平喘汤混合对照品、供试品、阴性样品在251 nm高效液相色谱图

2.1.4 标准曲线的绘制 精密量取2.1.2 项下混合对照品溶液0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分别置于2 mL量瓶中，加50%甲醇稀释，得系列质量浓度工作溶液，按2.1.1 项下色谱条件测定，以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X），得回归方程，见表1。结果表明，各成分在进样范围内线性关系良好。

表1 温肺平喘汤5个成分的线性关系

2.1.5 精密度试验 吸取上述混合对照品溶液，连续进样6 次，测定峰面积，经计算芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B 和甘草酸峰面积的RSD 分别为1.85%、0.94%、0.60%、0.53%、0.64%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，在制备后0、2、4、8、12、24 h 按2.1.1 项下色谱条件测定，计算芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B 和甘草酸峰面积的RSD 分别为0.48%、2.15%、0.64%、0.11%、0.45%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 精密量取同一供试品溶液6份，按2.1.1 项下色谱条件测定，计算芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B 和甘草酸含量的RSD 分别为1.22%、1.95%、0.57%、0.09%、0.42%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密量取提取液1 mL，平行6 份，加入混合对照品溶液1 mL（芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸质量浓度分别为0.460 0、0.029 6、0.019 6、0.478 0、0.017 2 mg·mL–1），13 000 r·min–1离心10 min（离心半径为18.7 cm），取上清液，按2.1.1 项下色谱条件测定，结果芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B 和甘草酸的平均加样回收率分别为98.22%、101.91%、103.87%、102.32%、100.47%，RSD 分别为2.25%、2.05%、1.08%、0.83%、1.33%，表明该方法回收率良好。

2.2 浸膏含量的测定

精密量取滤液10 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，计算浸膏的含量。

2.3 AHP-EWM权重的计算

2.3.1 AHP 确定权重系数 通过AHP 量化6 个指标成分的权重系数，根据中药复方君臣佐使配伍理论对各指标进行重要性排序，丹酚酸B>迷迭香酸>芍药苷>甘草苷>甘草酸>干膏得率，以此构成成对比较的优先矩阵，并获得各项指标的相对评分，结果见表2。根据表2 结果，AHP 法计算得到芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸和干膏得率6项指标权重系数分别为0.160 2、0.100 9、0.251 6、0.380 6、0.064 2、0.042 5。一致性比例因子（CR）=一致性检验因子（CI）/平均随机一致性指标（RI）=0.023 9<0.1，说明矩阵具有一致性，其相应求得的权重有效。

表2 温肺平喘汤目标成对比较判断优先矩阵

2.3.2 EWM 确定权重系数 以芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸的含量和干膏得率为评价指标，建立原始评价指标矩阵Y=（yij）m×n，根据公式（1）进行标准化处理得到矩阵P=（pij）m×n[16]。根据公式（2）计算第j个评价指标的信息熵（H）j，各指标的Hj分别为0.987 6、0.960 1、0.970 9、0.979 0、0.959 2、0.991 4。根据公式（3）计算第j个指标的权重系数（W）j，各指标的Wj分别为0.081 5、0.263 2、0.191 7、0.138 2、0.268 8、0.056 6。

式中，yij表示第i次试验时第j个评价指标的取值，pij表示第i次试验在第j个评价指标下的概率。

2.3.3 AHP-EWM 组合确定指标综合权重 通过AHP 得到Wj-AHP，EWM 得到Wj-EWM，根据公式（4）计算综合权重值（Mj），结果得到芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸的含量和干膏得率6个评价指标的Mj分别为0.081 5、0.165 9、0.301 2、0.328 5、0.107 8、0.015 0。AHP与EWM 所得权重系数之间的r为–0.113，两者相关性不显著（P=0.831>0.05），说明两者所反映的信息不具有叠加性，Mj所反映信息更加全面[17-18]。

2.4 制备工艺正交试验及结果

选择加水倍量（A）、提取时间（B）和提取次数（C）为考察因素，以芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸含量及干膏得率为指标进行综合评分，按公式（5）计算综合评分。采用L9（34）进行试验，因素水平见表3，试验结果见表4，方差分析见表5。结果表明三因素中对综合评分影响大小分别为C>B>A，3 个因素对综合评分的影响均无统计学意义。于是对各因素的3 个水平值进行两两比较，综合考虑优选最佳工艺参数为A2B2C3，即8 倍加水量、加热时间1.0 h、提取3次。

表3 温肺平喘汤正交试验因素水平

表4 温肺平喘汤正交试验设计和结果

表5 温肺平喘汤综合评分的方差分析

2.5 验证实验

按优选的工艺条件进行验证实验，平行3 次，结果见表6，3 次验证实验综合评分分别为98.78、99.05、98.66，RSD<3%，说明优选的提取工艺稳定可行。

表6 温肺平喘汤最优提取工艺验证实验结果

3 讨论

本研究采用二极管阵列检测器对芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸5个成分进行紫外全波长扫描（190～400 nm），为了保证各个成分的分离度、灵敏度、丰度等较好，最终选择芍药苷、甘草苷230 nm、迷迭香酸330 nm、丹酚酸B 286 nm、甘草酸251 nm 为检测波长。AHP 是一种较为主观的层次化的分析方法，可以对多种指标进行赋权，适合中药多成分多指标权重的计算，对决策问题进行数学化，增强了总体评价结果的可信度[19-20]。EWM是一种客观的赋权方法，和指标的离散程度有关，根据熵值携带的信息和指标的变异程度计算各指标的权重系数[21-22]。AHP-EWM 确定权重系数的方法结合主客观赋权法，更加真实可靠，符合实际要求[23]。本研究根据此种方法确定了芍药苷、甘草苷、迷迭香酸、丹酚酸B、甘草酸和干膏得率6项指标权重系数分别为0.081 5、0.165 9、0.301 2、0.328 5、0.1078、0.015 0。

本研究选择提取时间、加水倍量和提取次数为考察因素，通过预试验发现丹酚酸B、迷迭香酸等化合物部分结构不稳定，随着加热时间的延长含量降低。采用正交试验对该方的提取工艺进行优化，并对结果进行综合分析。结果表明，提取次数影响最大，提取时间次之，加水倍量影响最小，最终结合实际生产的需要确定最优工艺为8 倍加水量、加热时间1 h、提取3 次。经验证，优化的工艺稳定可行，可为该方的后续开发提供参考。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。