温肺化纤汤干预肺纤维化大鼠肺组织中Nrf2含量研究

李少峰，魏兴洪，高 洁，兰智慧，张元兵

(1.江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330006；2.赣州市南康区第二人民医院，江西 赣州 341411；3.南昌市洪都中医院，江西 南昌330006)

肺纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)是指因各种原因引发的弥漫性肺部炎性疾患，病变多累及肺间质、肺泡上皮细胞及肺血管，在我国发病率呈逐渐上升态势。肺纤维化是一个进行性、破坏性、基本不可逆的疾病，目前的治疗手段效果甚微，确诊后平均存活期为2～5年[1-2]。因此，明确肺纤维化发病机制迫在眉睫，近年来国内外专家提出氧化/抗氧化失衡引起的氧化应激反应是其发病重要机制之一[3]，Nrf2/ARE信号通路可调控抗氧化蛋白及Ⅱ相解毒酶的表达，通过抗氧化而发挥对机体的保护作用，其作为体内重要抗氧化调节通路，已成为多学科研究热点。

温肺化纤汤是江西省名中医刘良徛教授治疗PF临床经验方，该方传承于国医大师洪广祥教授“治肺不远温”学术思想，团队经过多年临床验证，临床疗效确切，已获得国家发明专利(专利号：ZL201210365678.0)，并由我们牵头制定《肺痿诊疗专家共识意见(江西省)》[4]。温肺化纤汤方由《外科证治全生集》的阳和汤化裁而来，具有温阳化痰、活血化瘀的作用，前期药理实验表明，温肺化纤汤具有一定的体外抗氧化活性[4-9]，但具体机制不明确，本研究从抗氧化应激角度探讨温肺化纤汤的作用机制，阐明其作用靶点，为防治肺纤维化提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD雄性大鼠，SPF级，体重180 g。

1.2 药物

温肺化纤汤组成：熟地20 g，肉桂4 g，鹿角霜15 g，麻黄10 g，白芥子10 g，炮姜10 g，桃仁10 g，土鳖虫10 g，红花10 g，川芎10 g，地龙10 g。按药物剂量比例制成温肺化纤汤投料处方，通过醇提取、挥发油提取及水提取等工艺流程，萃取、提纯药物成分，浓缩、干燥后制成温肺化纤汤颗粒剂。该药由广东一方制药有限公司制备和提供。

1.3 试剂及仪器

硫酸博来霉素(MB1039)。胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)比色法测试盒，总超氧化物歧化酶(SOD)比色法测试盒，过氧化氢酶(CAT)比色法测试盒。RNAiso Plus(TaKaRa，9109)、GAPDH、NRF2引物均由福州尚亚生物科技有限公司合成，RIPA强裂解液(凯基，KGP702)，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(碧云天，P0015L)，封闭液(碧云天，P0023B)，普通PCR仪、蛋白垂直电泳仪、化学发光成像系统、小型垂直电泳槽、酶标仪(美国BIO-BAD公司)，荧光定量PCR仪(美国ABI，7300)。

1.4 分组给药

适应性喂养大鼠1周后，用随机数字表法分成模型组和正常组，温肺化纤汤低、中、高剂量组，每组3只。参考文献[7]造模方法，建造肺纤维化大鼠模型，即正常组大鼠予以基础饲料，同时，各组灌服相应剂量的温肺化纤汤颗粒或饮用水，治疗4周。参考文献[7]相关资料的干预剂量，温肺化纤汤高剂量组为5倍临床剂量，0.9 g药物颗粒，温肺化纤汤中剂量组为3倍临床剂量，0.54 g药物颗粒，温肺化纤汤低剂量组为临床等效剂量，0.18 g药物颗粒，建模后第2日起进行3次灌胃，每次3 mL温肺化纤汤灌胃。

1.5 标本采集

造模28天后进行取材，麻醉大鼠后取肺脏组织。样品分成4份。一份左肺，用4%多聚甲醛固定液固定，常温保存；右肺分成3份，保存于-80 ℃冰箱。

1.6 病理学观察

挑选3块新鲜肺组织样本，每块大小约1 cm×1 cm×1 cm，将肺组织样本用固定液固定在冰冻切片机上，时长为15 min，切为10 μm左右厚度的切片，用光镜观察常规油红HE染色后的脂滴分布状况。

1.7 Nrf2mRNA

应用实时荧光定量PCR的方法测定，总RNA提取试剂盒提取肺组织RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，全自动荧光定量PCR仪增大并测定荧光。Nrf2引物序列：上游F：CCTCTGCTGCCATTAGTCAGT，下游：R：CTTCAGTGTGCTTCTGGTTGA，GAPDH引物序列：上游：F：GACTCCACTCACGGCAAAT，下游：R：GACTCCACGACATACTCAGCA，反应条件为95 ℃预变性1 min后95 ℃变性20 s，而后56 ℃退火30 s，再72 ℃延伸30 s，最后循环40次。用比较Ct的方法测算mRNA相对表达倍数。

1.8 Western Blotting法测定Nrf2蛋白表达

将100 mg左右的肺组织放入含1 mmoL·L-1·kg-1PMSF的500 μL RIPA裂解液，研磨组织，充分裂解，配平后于4 ℃，12 000 r·minkg-1离心20 min，取上清液低温待用，并测定蛋白含量。样本通过SDS-PAGE电泳后分离出蛋白，转移PVDF膜上，从电转槽中取出膜，漂洗TBS，置于封闭液中室温摇荡2 h；转膜，加一抗稀释液4 ℃摇床，洗膜，加入二抗稀释液，于4 ℃室温下孵育1 h，洗涤后于暗室在X光片上显影，ECL显色剂按A∶B =1∶1的比例现配现用，注意避光，用化学发光仪显影拍照。将显影后的数据用image lab分析。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察

正常组大鼠形体正常，精神状态好，活动自如。模型组大鼠形体肥胖，精神倦怠，动作迟缓，体毛枯黄易脱落，进食、饮水量大，大便质软，垫料湿度大。温肺化纤汤高、低剂量组大鼠的精神、形体、活动、毛发、饮水、进食、排泄物均更佳，以温肺化纤汤高剂量组的改善情况最为明显。

2.2 大鼠肺组织病理变化

正常组大鼠肺细胞核为蓝色，细胞内未有显著的橘红色脂滴，间隙清晰，肺窦正常。模型组大鼠细胞明显肿大，出现弥漫性红染脂滴，相邻肺细胞内脂滴融合，细胞核多被挤压于一侧。温肺化纤汤高、低剂量组橘红色脂滴少于模型组，其中以温肺化纤汤高剂量组改善较显著(见图1)。

注：A.对照组；B.模型组；C.低剂量处理组；D.中剂量处理组；E.高剂量处理组。

2.3 大鼠肺组织Nrf2水平比较

通过Western Blotting法对肺纤维化大鼠肺组Nrf2表达水平进行检测，进一步明确温肺化纤汤增强抗氧化能力的机制。结果表明，与对照组比较，肺纤维化、中、高剂量温肺化纤汤处理组胞核Nrf2表达水平增加(P<0.05)。与模型组相比，高剂量处理组温肺化纤汤胞核Nrf2表达水平增加，差异有统计学意义(P<0.01)。与低剂量温肺化纤汤处理组比较，中、高剂量温肺化纤汤处理组上述指标明显改善(P<0.05)。中、高剂量温肺化纤汤处理组间比较无统计学意义(P>0.05)(见图2、图3)。

3 讨论

研究认为，氧化与抗氧化失衡同肺纤维化的发病息息相关，在该病的病理演变中起着十分重要的作用[3]。目前，中医药在PF领域主要通过调节细胞因子、抑制细胞外基质合成、调节氧化应激系统来防治，是一个多方位的过程[10]。江西省名中医刘良徛教授认为PF是一个本虚标实之证，阳虚是本病的内因，阳虚证候可出现在肺纤维化病情发生发展过程中，痰和瘀是本病的继发因素，阳虚、痰浊、血瘀构成了PF的3个主要环节[11-12]。基于全程温肺理论，刘教授创制了具有温阳散寒、化痰行瘀之功的温肺化纤汤治疗PF，疗效较好。前期实验结果显示，温肺化纤汤具有一定的抗氧化活性，可改善博来霉素致大鼠肺纤维化模型的肺组织损害，纤维组织增生减少[13-14]，纤维化评分降低，这些都提示抗氧化是温肺化纤汤治疗肺间质纤维化的有效途径。

注：1.对照组；2.模型组；3.低剂量处理组；4.中剂量处理组；5.高剂量处理组；采用实时荧光定量PCR(qRT- PCR)法测定肺组织Nrf2mRNA的表达，*为与模型组、对照组、低剂量组比较，P<0.05；**为与模型组、对照组、低剂量组比较，P<0.05。

Nrf2是调控氧化应激最具代表的核转录因子。生理情况下，细胞质中的Nrf2与Keap1偶联后以失活状态固定于胞质内，泛素化后由26 S蛋白酶体所降解，当遭受氧化剂刺激后，Keap1被氧化发生构象改变，随后与Nrf2解偶联，Nrf2释放后转位入胞核内，与抗氧化反应元件结合，诱导下游SOD、CAT、GSH等抗氧化酶基因的转录，从而调控细胞内抗氧化酶表达[15]。

本研究主要检测了肺组织中Nrf2的含量。与对照组比较，肺纤维化组、中、高剂量温肺化纤汤处理组胞核Nrf2表达水平增加(P<0.05)，差异具有统计学意义，即空白组大鼠肺组织中Nrf2含量最低，提示博莱霉素致大鼠肺纤维化模型造模基本成功。与模型组相比，高剂量处理组温肺化纤汤Nrf2表达水平增加，差异有统计学意义(P<0.01)，说明应用高剂量后实验大鼠肺组织中的Nrf2指标变化明显。与低剂量温肺化纤汤处理组比较，中、高剂量温肺化纤汤处理组上述指标明显改善(P<0.05)，说明中、高剂量是有效药物浓度。然而，中、高剂量温肺化纤汤处理组间比较差异不明显(P>0.05)，换言之，应用中、高剂量后实验大鼠肺组织中的Nrf2指标变化不明显。

图3 GAPDH、Nrf2溶解曲线

综上，温肺化纤汤可能通过增加Nrf2蛋白，干预实验性肺纤维化，但本实验相对简单，仅探讨了在肺纤维化形成过程中Nrf2表达的作用，而具体的作用机制、是否有其他通路的作用等方面还需进一步深入研究。