温肺降浊方对血管性痴呆大鼠海马神经元的作用机制

姜明贺,张 鼎,朱欢欢,李方存,李丽琴,宋晨曦,陈 炜,胡跃强

(1.广西中医药大学,广西 南宁 530001;2.广西中医药大学附属瑞康医院,广西 南宁 530011;3.广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023)

痴呆是一种不可逆性的疾病,可导致进行性认知能力下降,已经成为主要的健康问题之一[1]。血管性痴呆(Vascular dementia,VaD)是仅次于阿尔茨海默病的第二大痴呆病因[2]。虽然VaD的病因病理机制尚不清楚,但主要聚焦于神经血管单位破坏、胆碱能功能退化、氧化应激、炎症反应、血脑屏障破坏等诸多因素[3]。慢性脑灌注不足引起的线粒体功能障碍可导致神经元内大量活性氧蓄积,进而激活内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)通路[4]。同时,ERS是通过激活未折叠蛋白反应来维持内质网内部的细胞稳态,且持续性的ERS能够激活下游蛋白,如胱天蛋白酶-12、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)等,进而导致细胞死亡[5]。最新证据显示,当抑制VaD大鼠脑内的ER应激反应可以有效改善其认知障碍[6]。因此,内质网应激反应是VaD发生发展过程中的一项重要因素。

血管性痴呆在中医学中并无专属病名,然而根据其临床表现,中医学将其归属于“呆病”范畴。历代医家多以心血亏虚、肾精不足以致脑窍失荣论治,故在治疗上多以补益心肾为主。本团队提出“从肺治脑”的理论,创制温肺降浊方,施于临床疗效较好。前期的基础研究显示,该方具有抗氧化、抗凋亡和调节免疫作用,且温肺降浊方可改善VaD大鼠的认知障碍,对老年性大鼠具有神经保护作用[7-9]。然而,温肺降浊方是否参与了沉默信息调节因子1(Silent information regulator 1,SIRT1)/ERS通路对VaD的保护作用尚不清楚。因此,提出温肺降浊方能够通过调节SIRT1/肌醇需求酶1α(Inositolrequiring enzyme 1α,IRE1α)/剪接型X-盒结合蛋白1(Spliced X-box binding protein 1,XBP1S)/CHOP信号通路来改善大鼠海马CA1区神经元损伤的假设,探讨其改善认知功能障碍的作用机制,为后续基础研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:健康成年雄性SPF级SD大鼠,购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物质量合格证号(SCXK湘2019-0004)。实验动物饲养于广西中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室。本研究经广西中医药大学科学实验中心动物伦理委员会批准,批准编号DW20230425-105。

1.1.2 主要试剂和仪器:无水乙醇(批号10009218);二甲苯(批号10023418);苏木精(批号H9627);伊红Y(批号71014544);中性树胶(批号10004160);SIRT1抗体(批号ab62352);IRE1α抗体(批号ab125066);XBP1s抗体(批号ab227828);CHOP抗体(批号ab179800);彩虹180广谱蛋白Marker(批号PR1910);显微镜(型号BX53,日本奥林巴斯公司);PCR梯度基因扩增仪(型号SCI1000-G,美国赛洛捷克公司);小型垂直电泳转印系统(型号1658033,美国伯乐公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备和分组:适应性喂养大鼠2周,体重保持在(250±30) g左右,随机分为假手术组、模型组、温肺降浊方低剂量组、温肺降浊方中剂量组、温肺降浊方高剂量组,每组6只大鼠。大鼠通过双侧颈总动脉永久性结扎建立VaD模型大鼠,具体操作为40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉,经颈部正中切开,暴露双侧颈总动脉,轻轻分离双侧颈总动脉和迷走神经,用6-0号丝线结扎双侧颈动脉并剪断。假手术组只暴露动脉不进行结扎和剪断。整个手术过程操作轻柔,减少触碰迷走神经,术后用加热毯维持大鼠体温。

1.2.2 实验药品及制备:温肺降浊方由制附子(先煎)20 g,党参 15 g,干姜、田七、酒大黄各10 g,炙甘草 6 g组成。所有药物购买于广西中医药大学第一附属医院门诊中药房,本方分两次煎煮,取汁200 ml,加热浓缩至含有原药材1.5 g/ml。尼莫地平片(批号211274)。

1.2.3 动物给药:手术后4周开始给药,模型组、假手术组予以等体积0.9%氯化钠溶液灌胃,西药组给予尼莫地平20 mg/(kg·d),温肺降浊方低剂量组、温肺降浊方中剂量组、温肺降浊方高剂量组分别予以温肺降浊汤3.75、7.5、15 g/(kg·d)灌胃给药,持续4周。

1.2.4 Morris水迷宫试验:给药4周后,采用Morris水迷宫试验评估大鼠的空间学习记忆能力。Morris水迷宫试验的设备由一个黑色圆形池、一个逃生平台和记录系统组成,圆形池中加入无毒黑色墨水,加热使水温保持在(23±1) ℃,将圆形池分成四个相等的象限。将逃生平台放置在目标象限中心的水面以下2 cm处。定位航行试验中,大鼠每天从4个不同的位置被释放,持续5 d。记录大鼠逃避潜伏期和总路程。每个象限测试时间为60 s。若大鼠成功登台,停留15 s,未成功登台则人工引导大鼠至平台停留20 s。第6天进行空间探索试验,取出逃生平台,将平台所在象限设为目标区,从目标区对侧象限将老鼠放入水中,自由游动60 s,记录大鼠在目标象限上的停留时间、原始平台位置的穿越次数。

1.2.5 HE染色和尼氏染色:水迷宫测试结束后进行取材,取材前各组大鼠禁食禁水24 h,用1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔过量麻醉后,每组取3只大鼠,进行心脏灌注,立刻断头取脑,用4%多聚甲醛溶液浸泡24 h,然后用石蜡包埋,制作3 mm厚的切片。脱蜡后,进行HE染色和尼氏染色,最后用中性树脂封片,光学显微镜下观察海马组织形态。

1.2.6 RT-qPCR检测SIRT1、IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表达水平:总RNA严格按照Trizol试剂盒说明提取,微量分光光度计测定OD值,计算RNA的纯度和浓度。将总RNA逆转录为cDNA,反应条件为42 ℃、2 min,50 ℃、15 min,85 ℃、5 s,4 ℃、10 min,1个循环。扩增程序分为两步95 ℃预变性10 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火延伸45 s。以GAPDH为内参,2-ΔΔCt法计算最终mRNA相对表达量。PCR引物由武汉伯韬生物科技有限公司合成,引物序列,见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.2.7 Western blot检测SIRT1、IRE1α、p-IRE1α、XBP1s、CHOP蛋白水平:从-80 ℃冰箱取出各组大鼠海马组织,剪出一部分海马组织放入装有钢珠的1.5 ml EP管中,自动制冷匀浆机匀浆,加RIPA裂解液,加入PMSF蛋白酶抑制剂,BCA蛋白检测试剂盒进行定量分析。根据分子量制备相应分离胶,通过电泳、转膜、5% BSA封闭,TBST洗膜,一抗主要有SIRT1(1∶2000)、IRE1α(1∶2000)、XBP1s(1∶2000)、CHOP(1∶2000)孵育,4 ℃过夜;TBST洗膜3次,每次10 min,稀释二抗比例为1∶5000,将PVDF膜放置于二抗中,37 ℃摇床孵育1.5 h,TBST洗膜,超敏ECL显色后曝光,以GAPDH为内参,计算目的蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠Morris水迷宫实验结果比较 见表2(图1)。术后4周,与假手术组比较,模型组、西药组、温肺降浊方各剂量组大鼠逃避潜伏期明显延长,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,穿越平台次数明显减少,差异有统计学意义(P<0.01),模型组、西药组、温肺降浊方各剂量组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。术后8周,温肺降浊方低剂量组逃避潜伏期、穿越平台次数与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。温肺降浊方中剂量组、温肺降浊方高剂量组和西药组逃避潜伏期均短于模型组,穿越平台次数则增加,差异有统计学意义(P<0.05)。西药组上述观察项与温肺降浊方高剂量组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

A:假手术组;B:模型组;C:西药组;D:温肺降浊方低剂量组;E:温肺降浊方中剂量组;F:温肺降浊方高剂量组

表2 各组大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数比较

2.2 各组大鼠病理学表现比较 见图2、3。假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞排列规则紧密,细胞数目较多,形态大圆饱满,胞浆满布尼氏小体;模型组大鼠海马CA1区神经元细胞排列杂乱松散,细胞数量较少,形态不规则,部分出现细胞核深染固缩,甚至破碎消失,尼氏小体含量明显减少;与模型组比较,西药组和温肺降浊方各剂量组大鼠海马CA1区神经元损伤减轻,细胞内部结构更加完整,存活的神经元数量增加,尼氏小体含量增多,其中以西药组和温肺降浊方高剂量组最显著。

A:假手术组;B:模型组;C:西药组;D:温肺降浊方低剂量组;E:温肺降浊方中剂量组;F:温肺降浊方高剂量组

A:假手术组;B:模型组;C:西药组;D:温肺降浊方低剂量组;E:温肺降浊方中剂量组;F:温肺降浊方高剂量组

2.3 各组大鼠SIRT1、IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表达比较 见表3。与假手术组比较,模型组大鼠海马组织SIRT1 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.01)。模型组IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表达高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,西药组、温肺降浊方各剂量组大鼠海马组织SIRT1 mRNA表达升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,西药组、温肺降浊方各剂量组大鼠海马组织IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表达降低,差异有统计学意义(P<0.01)。

表3 各组大鼠SIRT1、IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表达比较

2.4 各组大鼠SIRT1、IRE1α、p-IRE1α、XBP1s、CHOP蛋白表达比较 见表4(图4)。与假手术组比较,模型组大鼠海马组织中SIRT1蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.01)。与假手术组比较,模型组大鼠海马组织中p-IRE1α/IRE1α、XBP1s、CHOP蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,西药组、温肺降浊方各剂量组大鼠海马区SIRT1蛋白表达升高,且西药组、温肺降浊方高剂量组大鼠海马区SIRT1蛋白表达最高,差异有统计学意义(P<0.01)。西药组与温肺降浊方高剂量组SIRT1蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比,西药组、温肺降浊方各剂量组p-IRE1α/IRE1α、XBP1s、CHOP蛋白下降,且西药组、温肺降浊方高剂量组大鼠各项蛋白表达最低,但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

A:假手术组;B:模型组;C:西药组;D:温肺降浊方低剂量组;E:温肺降浊方中剂量组;F:温肺降浊方高剂量组

表4 各组大鼠海马区各项蛋白表达量比较

3 讨 论

VaD好发于老年人,且多继发于脑血管病之后,随着人口老龄化及社会科学技术发展,VaD的发病率逐年升高[10-11]。目前,西医治疗VaD主要是抗血小板聚集、预防脑血栓形成、扩张血管、改善脑供血和营养神经等,但其疗效有限,且会产生一定不良反应,而中医药治疗VaD,因其多靶点效应,治疗效果较好,具有独特优势[12-13]。

中医学中呆病多见呆傻愚笨、智能低下、善忘等神志异常症状,其病位主要在脑,与五脏功能失调相关[14]。本研究认为,肺脏功能失调与痴呆发病关系密切,肺藏气,气舍魄,肺气亏虚,魄无所舍,可导致痴呆。肺主宣发肃降,参与全身水液代谢,若肺阳气亏虚,则水液不能正常布散,聚湿生痰,蒙蔽清窍,导致痴呆。肺的肃降还影响肾的蛰藏功能,若肺失肃降,则肾不能正常藏精,无以濡养清窍,可发为痴呆。肺朝百脉,助心行血,肺阳气亏虚,可导致血行不畅,血脉瘀滞,阻塞脑络,清窍失养,发为痴呆。此外,肺与大肠相表里,肺失宣降则大肠传导功能失司,糟粕结于肠道,化生浊毒,上干脑窍,亦可发为痴呆。故治疗应予以温肺降浊之法,方用温肺降浊汤,方中附子、干姜温肺散寒为君药,党参补益肺气为臣药;田七活血化瘀,酒大黄下瘀血、破积聚、荡涤肠胃、推陈致新、通利水谷、安和五脏共为佐药;炙甘草补中缓急、润肺降逆、调和诸药为使;全方共奏温肺降浊之功。

Morris水迷宫试验是检测大鼠学习和记忆能力的首选试验[15]。本研究结果显示,术后4周模型组、西药组和温肺降浊方各剂量组大鼠逃避潜伏期较假手术组明显延长,穿越平台次数明显减少,说明VaD大鼠学习和记忆能力明显下降,造模成功。应用温肺降浊方干预后,术后8周水迷宫结果显示,温肺降浊方中剂量组和温肺降浊方高剂量组大鼠逃避潜伏期较模型组明显缩短,穿越平台次数明显增加,且温肺降浊方高剂量组疗效与尼莫地平组相当,说明温肺降浊方可改善VaD大鼠的学习和记忆能力。

海马CA1区与学习和记忆能力密切相关[16]。本研究结果显示,与假手术组比较模型组大鼠海马CA1区病理损伤严重,神经元细胞明显减少,且排列疏松紊乱。应用温肺降浊方干预后,温肺降浊方各剂量组大鼠海马CA1区病理损伤较模型组不同程度减轻,神经元细胞明显增加,且排列紧密有序,说明海马CA1区病理损伤与VaD大鼠学习和记忆能力下降有关,且温肺降浊方可减轻VaD大鼠海马CA1区病理损伤。

有研究表明,ERS与VaD中的学习及记忆缺陷程度相关[17]。ERS通过激活未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)来维持内质网内的细胞内稳态[18]。IRE1α是激活ERS的关键因子。当UPR发生时,蛋白激酶R样内质网激酶、IRE1α和激活转录因子6(Activating transcription factor 6,ATF6)三条ERS途径被激活以维持细胞内稳态[19-21]。当UPR超过内质网的负荷时,会激活XBP1s,并被转移到细胞核以外进而激活CHOP蛋白,导致神经元凋亡[22]。SIRT1是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性脱乙酰酶,被认为参与细胞衰老和老化的调节,在神经变性疾病中起关键作用[23]。SIRT1可调节树突和轴突生长,在神经系统的发育中发挥重要作用,并对记忆和突触可塑性具有调节作用[24]。有研究发现,提高大鼠体内SIRT1表达可以改善其认知及学习水平,减少神经元损失,抑制炎症,并且抑制VaD大鼠海马中细胞凋亡和氧化应激。此外,多项报道已经证实,SIRT1的激活可以减轻由ERS引起的细胞损伤,并且下调ERS通路表达水平[17-19]。还有研究证实,SIRT1可以使真核生物起始因子2a脱乙酰化,以减少神经细胞由ERS引起的损伤[25]。本研究显示,在VaD模型组大鼠中SIRT1 mRNA和蛋白表达水平明显下降,IRE1α、XBP1S、CHOP mRNA和XBP1S、CHOP蛋白以及p-IRE1α/IRE1α水平明显升高,说明VaD发生时ERS被显著激活。温肺降浊方通过激活SIRT1,下调IRE1α/XBP1s/CHOP通路,从而抑制ERS。