基于稳定同位素内标的高效液相色谱串联质谱法测定乳制品中L-岩藻糖的含量

杨倩倩 何姝 曹晶

DOI： 10.3969/J.ISSN.1000-5137.2024.01.005

收稿日期： 2023-11-01

基金项目： 上海市科技创新行动计划（20JC1416800）

作者简介： 杨倩倩（1999—）， 女， 硕士研究生， 主要从事食品检验检测和分析等方面的研究. E-mail： 1730813139@qq.com

* 通信作者： 曹 晶（1981—）， 女， 副研究員， 主要从事食品检验检测和分析等方面的研究. E-mail： caojing@shnu.edu.cn

引用格式： 杨倩倩， 何姝， 曹晶. 基于稳定同位素内标的高效液相色谱串联质谱法测定乳制品中L-岩藻糖的含量 ［J］.上海师范大学学报 （自然科学版中英文）， 2024，53（1）：35?43.

Citation format： YANG Q Q， HE S，CAO J. Determination of L-fucose content in dairy products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with stable isotope internal standard ［J］. Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences）， 2024，53（1）：35?43.

摘  要： 基于稳定同位素内标（SIIS），构建了一种简单的乳制品前处理方法，将乳制品中的L-岩藻糖（L-Fuc）高效地游离出来，利用高效液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）建立了乳制品中L-岩藻糖含量的定量测定方法. 首次引入SIIS来定量乳制品中的L-岩藻糖，采用电喷雾离子源（ESI）负离子扫描模式和多重反应监测（MRM）模式进行定量分析. 研究过程中对质谱鉴定、色谱条件、样品前处理过程都进行了方法的比较优化，并检测了纯牛奶、酸奶等5种乳制品中L-岩藻糖的含量. L-岩藻糖在0.001～1.000 ?g·mL-1范围内线性关系良好，相关系数为0.999 99，样品加标回收率在71.67%～117.27%之间，相对标准偏差（RSD）在2.00%～9.64%之间，检出限为0.1 ng·mL-1，定量限为0.5 ng·mL-1. 该方法样品前处理简单，灵敏度高，检测结果准确，可定量不同乳制品中L-岩藻糖的含量，为其他领域中L-岩藻糖含量的测定提供了可借鉴的方法.

关键词： L-岩藻糖（L-Fuc）； 稳定同位素内标（SIIS）； 液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）； 多重反应监测（MRM）； 乳制品

中图分类号： O 65    文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2024）01-0035-09

Abstract： Based on the stable isotope internal standard（SIIS）， a simple dairy pretreatment method was established to efficiently separate the L-fucose（L-Fuc） from dairy products. A quantitative method for L-fucose content in dairy products was established using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）. SIIS coupled with LC-MS/MS to quantify L-fucose was employed for the first time. The method used electronic spray ionization（ESI） mode and multi reaction monitoring（MRM） mode for quantitative analysis. During the study， the mass spectrometric identification， chromatographic conditions， and sample preparation were optimized， and the content of L-fucose in five kinds of dairy products， such as pure milk and yogurt， was detected. The results showed that the linear range of L-fucose was 0.001-1.000 ?g·mL-1， and the correlation coefficient was 0.999 99. The recoveries were 71.67%-117.27%， and the relative standard deviations（RSD） were 2.00%-9.64%. The limit of detection was 0.1 ng·mL-1， and the limit of quantification was 0.5 ng·mL-1. This method has the advantages of simple sample preparation， high sensitivity， accurate detection results， and can be used to quantify the L-fucose in different dairy products. It provides a reference method for the determination of L-fucose content in other fields.

Key words： L-fucose（L-Fuc）； stable isotope internal standard（SIIS）； liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）； multi reaction monitoring（MRM）； dairy products

0  引 言

岩藻糖（Fuc）是六碳糖的一种，又称6-脱氧-L-半乳糖，也可以看作是一种甲基戊糖. 自然界中的岩藻糖绝大多数为L-岩藻糖（L-Fuc），D构型的岩藻糖仅作为一种稀有糖发现于一些糖苷类化合物中. L-岩藻糖是一种特殊的单糖，存在于哺乳动物细胞产生的各种糖脂和糖蛋白中，与一般的六碳糖相比，岩藻糖独特之处在于其结构上在六号碳原子处少一个羟基，所以岩藻糖具有L构型，而哺乳动物中所有其他天然存在的糖都以D构型的结构存在［1-3］. L-岩藻糖在某些血型物质分子中是一定的血型标记物，同时也是人乳、牛乳中的单糖之一，具有消炎、抗凝血、抗肿瘤、抗癌、抗获得性免疫缺陷综合征等功效［4-7］. 由于牛乳中的L-岩藻糖含量很低，人们可以结合对L-岩藻糖的认识，将其添加至乳饮品中提高食品的营养价值，作为理想的膳食补充剂和幼儿的营养补充剂［8］.

目前，对L-岩藻糖含量的测定方法有比色法［9-10］、离子色谱法［11-12］、气相色谱法［13］、高效液相色谱法［14-21］、高效液相色谱-串联质谱法［22-24］等. 比色法易受到其他可与显色试剂反应的物质的干扰；离子色谱法检测用时长且准确性低；气相色谱法必须将单糖衍生化才能进行分析，步骤繁琐；高效液相色谱法主要分为直接测定法［14-15］和柱前衍生法［16-19］两种方法. 直接测定法常采用蒸发光散射检测器（ELSD）［14］或示差折光检测器（RID）［15］，RID对环境温度的稳定性要求较高，且灵敏度低，ELSD灵敏度比RID稍高，但仍不理想. 柱前衍生法需要用紫外［20］或荧光［21］试剂对单糖进行衍生，使其能够被检测，操作繁琐且常出现异常干扰，影响分析的准确性. 液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）中质谱的灵敏度较高，且具有分离鉴定同时进行的优点，与常用检测器相比较，质谱作为检测器时根据其提供的相对分子质量和子离子信息以及子离子所对应的质谱图，可以更快更准确地定性与定量［24］，但该方法仍受到基质效应的限制. 因此，本研究拟开发一种高效游离L-岩藻糖的前处理方法，基于LC-MS/MS法，引入稳定同位素内标（SIIS）L-［UL-13C6］Fucose，利用其與待测物有相似的理化性质来消除样品中的基质干扰，提高检测的准确性，定量不同乳制品中L-岩藻糖的含量.

1  材料与方法

1.1 仪  器

Ultivo高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪，美国Agilent公司；BSA224S电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；LP漩涡振荡器，美国Thermo公司；Centrifuge-V医用离心机，赛默飞世尔仪器有限公司；SB-3200 DTD超声波水浴，宁波新芝生物科技股份有限公司；JXH-100恒温混匀仪，上海净信实业发展有限公司；Millipore超纯水净化器，美国MILLIPORE公司.

1.2 试  剂

纯牛奶、酸奶、脱脂高钙奶粉、全脂高钙奶粉、奶酪均购于本地超市；甲酸，LC-MS级，赛默飞公司；乙酸，质量分数为99.5%，东京化成工业株式会社；乙酸铵，质量分数为99%，北京百灵威科技有限公司；乙腈，质量分数为99%，赛默飞公司；L-岩藻糖，质量分数为99%，上海贤鼎生物科技有限公司；L-岩藻糖的同位素化合物L-［UL-13C6］Fucose，质量分数为95%，上海赛尔斯生化科技有限公司；实验用水均为超纯水.

1.3 标准溶液的配制

精确称取L-岩藻糖标准品10 mg，用超纯水配制成1 mg·mL-1的标准储备液，于-20 ℃下储存备用.

将1 mg的L-［UL-13C6］Fucose同位素标准品用超纯水配制成1 mg·mL-1的内标标准储备液，于-20 ℃下储存备用.

混合内标标准工作液的制备：精确移取一定量的标准储备液和内标标准储备液用超纯水逐级稀释成1.000，0.500，0.250，0.050，0.025，0.005和0.001 ?g·mL-1的L-岩藻糖标准工作液，其中内标质量浓度均为0.05 ?g·mL-1，于4 ℃下储存备用.

1.4 样品前处理

精密称取20 mg（精确至0.1 mg）实际样品于离心管中，加入1 mL体积分数为50%的乙酸水溶液，振荡混匀，水浴超声10 min，使样品充分溶解. 在恒温混匀仪中50 ℃下反应1 h，酸解后冷却至室温，离心2次（15 000 r·min-1，10 min）. 离心后取下层清液稀释100倍，并加入内标标准工作液，使其质量浓度与混合标准工作液中内标浓度一致（为0.05 ?g·mL-1）. 接着用超滤管14 000g离心10 min，过0.22 ?m的水系滤膜，上机待测.

1.5 实验条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm，1.8 ?m）；柱温：25 ℃；流速：0.3 mL·min-1；进样量：1 ?L；流动相：0.05%（体积分数）甲酸水溶液（流动相A），0.05%（体积分数）甲酸的乙腈溶液（流动相B），流动相梯度洗脱程序见表1.

1.5.2 质谱条件

ESI扫描模式：负离子模式（ESI-）；质谱检测方式：MRM；毛细管电压：3 000 V；喷嘴电压：500 V；碰撞能量（CE）：9 V；裂解电压：77 V；鞘气流量：11 L·min-1；鞘气温度：325 ℃；雾化器压力：30 psi；干燥器流量：7 L·min-1；干燥器温度：250 ℃；MRM参数见表2.

2  结果与讨论

2.1 质谱条件的选择和优化

实验通过针泵进样，分别在电喷雾正离子和负离子扫描模式下对10 ?g/mL（质量浓度）的L-岩藻糖标准溶液和内标标准溶液进行母离子全扫描，结果表明，负离子模式下的信噪比高于正离子模式，基线更平稳，背景干扰峰少，因此实验选择负离子扫描模式. 在ESI-模式下，确定L-岩藻糖与内标的母离子的质荷比（m/z）分别是163.1和169.1，接着以这2个母离子进行子离子扫描，得到L-岩藻糖和内标的二级质谱主要特征碎片离子的质荷比分别是58.8*，89.1和61.2*，92.5，如图1所示. 在ESI-和MRM模式下优化CE与裂解电压，使母离子与特征碎片离子产生的离子对相对强度达到最大，以提高检测的灵敏度，优化后的质谱参数见表2.

图1 （a） L-岩藻糖和（b） 内标的子离子扫描质谱图

基于LC-MS/MS检测样品中的待测物时，样品中的一些共同提取物可能会产生基质效应，使待测物的响应信号增强或抑制，影响分析结果的准确性. 因此，为最大限度地降低基质效应，选择了一种同位素标记内标L-［UL-13C6］Fucose，在预处理前加入待测样品中，由于其与待测物L-岩藻糖的物理化学性质类似，有着相同的色谱保留时间、断裂模式、离子化效率，当内标和待测物的响应信号受到同样程度的抑制或增强时，任何离子化条件的改变只会影响绝对的峰面积，而待测物与内标的比值不会受到影响，因此，同位素标记法既可以抵消基质效应的影响，又能校正样品前处理过程中的误差，使分析结果更准确，如图2所示.

图2 混合内标与L-岩藻糖的MRM质谱图

2.2 色谱条件的选择和优化

2.2.1 色谱柱的选择

图3 （a） HILIC （150 mm） Column和（b） C18 （150 mm） Column的MRM色譜图

测定单糖时常选用C18色谱柱，鉴于L-岩藻糖富含羟基，属于亲水化合物，该研究比较了Eclipse Plus C18 Column（150 mm×2.1 mm，1.8 ?m）和Poroshell 120 HILIC Column（150 mm×2.1 mm，2.7 ?m）这2种色谱柱［25］. 结果表明：与HILIC Column 相比，C18 Column的分离效果更佳，峰形良好，峰面积更大，因此选择C18 Column，如图3所示. 由于L-岩藻糖多羟基，极性较大，出峰时间早，因此实验最终选择50 mm的Eclipse Plus C18 Column用于后续样品的测定来缩短检测时间和提高分析效率，如图4所示.

图4 C18 （50 mm） Column的MRM色谱图

2.2.2 流动相添加剂的选择

由于L-岩藻糖的极性较大，通常选择乙腈与水作为流动相，在流动相中有无添加剂也会影响样品的分离度与分析的灵敏度. 选择C18 Column后，在ESI-模式下考察了5 mmol·L-1乙酸铵的水溶液/乙腈溶液，0.05%（体积分数）甲酸的水溶液/乙腈溶液这2种流动相对分离的影响. 结果表明：添加剂为甲酸时，背景噪声小，基线更平稳，如图5所示，故选择0.05%（体积分数）甲酸的水溶液/乙腈溶液作为流动相，优化后的流动相梯度洗脱程序见表1.

图5 （a）5 mmol·L-1乙酸铵的水溶液/乙腈溶液和（b）0.05%甲酸的水溶液/乙腈溶液的流动相优化

2.3 样品前处理优化

乳制品是一种复杂的混合物，主要以脂质、蛋白质、低聚糖、维生素等其他生物活性物质组成［26］，而L-岩藻糖主要以岩藻基化的形式存在于乳制品中，因此，测定L-岩藻糖含量前需对样品中的低聚糖进行水解. 通常水解低聚糖的方式有2种：酸解和酶解，但酶解不仅对底物性质、反应温度要求严格，而且水解不完全，故本实验采用酸解法. 目前已报道的酸解法有：盐酸水解法、浓硫酸水解法、三氟乙酸水解法和乙酸水解法等［27］. 盐酸通常用于糖蛋白和含氨基脱氧糖的水解，在密闭环境中的高温条件下有氧化性和强酸性，易对低聚糖造成破坏. 硫酸主要用于水解中性糖，水解时需要严格控制硫酸的浓度，浓度过高易引起糖炭化. 三氟乙酸常用于植物细胞壁多糖、糖蛋白及糖胺聚糖的水解，在高温条件下具有氧化性且其毒性大. 经过多次对比实验，该研究最终选用体积分数为50%的乙酸水溶液作为水解酸，既能最低程度破坏L-岩藻糖，又能较好地将L-岩藻糖水解游离出来. 由于酸解过程中不可避免地会对单糖造成一定的破坏，导致测定结果偏低，若酸解不完全，又无法进行准确的定量分析，因此选择合适的酸解条件至关重要. 该实验对酸解温度（40，50，60，70，80，90 ℃）与酸解时间（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h）进行了考察，最终确定最佳的酸解温度为50 ℃，酸解时间为1.0 h.

样品以优化后的酸解条件处理后，实验采用了超滤法（超滤膜，0.22 ?m水系滤膜）对得到的L-岩藻糖粗品进行预分离纯化，除去样品中的蛋白质等大分子杂质. 超滤法预分离纯化样品时操作简便，分离效率高且条件温和，无成分破坏.

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线、检出限与定量限

L-岩藻糖标准工作液系列质量浓度为0.001，0.005，0.025，0.050，0.250，0.500和1.000 ?g·mL-1，同位素内标质量浓度为0.050 ?g·mL-1. 以L-岩藻糖标准品的质量浓度（X）为横坐标，L-岩藻糖标准品与同位素内标峰面积的比值（Y）为纵坐标绘制标准曲线. 结果显示：在0.001～1.000 ?g·mL-1范围内线性良好，相关系数（R2）为0.999 99. 以信噪比S/N≥3的计算方法得出检出限为0.1 ng·mL-1，以S/N≥10的计算方法得出定量限为0.5 ng·mL-1. 该方法的灵敏度可以满足乳制品中L-岩藻糖的检测要求.

图6 L-岩藻糖的标准曲线

2.4.2 加标回收率与精密度

精密称取实际样品20 mg，按照所建立的方法处理后进行测定. 依次在原含量樣品的基础上分别添加0.025，0.050和0.250 ?g·mL-1的L-岩藻糖标准品，在优化后的实验条件下，每个加标样品与空白样品均重复进样6次（n=6），计算加标回收率，结果见表3. 该方法的平均回收率为71.67%～117.27%，回收率较高；相对标准偏差（RSD）为2.00%～9.64%，精密度良好.

2.5 实际样品测定

将本地超市所购买的纯牛奶、酸奶等5种乳制品按1.4节样品前处理后，应用1.5节实验方法进样，测定样品中L-岩藻糖的含量，测定结果如表4所示.

3  结 论

该研究建立了一种基于SIIS的LC-MS/MS测定乳制品中L-岩藻糖含量的分析方法. 该方法样品前处理过程简捷，分析效率高，实验结果的重现性与精密度好，灵敏度高，能满足乳制品中L-岩藻糖的检测要求. 同时，首次引入了SIIS，最大限度地降低了基质效应的影响，使分析结果更准确. 因此，该方法可准确地定量乳制品中L-岩藻糖的含量，为乳制品的生产质量把控和质量鉴定提供有效的手段，并为其他领域中L-岩藻糖含量的测定提供可借鉴的方法. 例如，人尿液中的L-岩藻糖是一种常见的癌症临床生物标志物，因此，对L-岩藻糖含量的准确测定是至关重要的. 为深入了解L-岩藻糖的生物功能，众多临床研究者经过几十年的努力已经探索出了多种测定L-岩藻糖含量的分析方法，其中，应用最广泛的检测方法就是LC-MS/MS. 然而，实际样品中的成分极其复杂，大多数存在于实际样品中的该类生物分子由于基质效应的作用导致质谱响应信号较低，难以对低丰度的实际样品进行定量分析. 因此，还需进一步对该类生物分子进行有效的分离富集以增强检测的灵敏度，并将该方法应用于生物医学等领域，为临床生物标志物的检测提供参考.

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（责任编辑：郁慧，顾浩然）