使用数学模型对髁突颈骨折愈合过程中骨与软骨组织变化的研究*

谢 春, 邬琼辉, 祁 峰, 沈振宇△

华中科技大学同济医学院附属协和医院 1口腔医学中心 3口腔颌面发育与再生湖北省重点实验室 4检验科,武汉430022 2华中科技大学同济医学院口腔医学院,武汉 430030

下颌骨髁突骨折是一类常见的面部外伤性疾病,其中下颌骨髁突颈骨折最为典型,其发病率约占髁突骨折的36.6%[1-2]。临床上虽然针对成人髁突颈骨折的治疗方法首选手术治疗,但是对儿童髁突颈骨折的治疗选择存在手术治疗和非手术治疗的争议[3-4]。髁突颈骨折愈合过程中成骨效应和成骨量是临床骨折愈合的重要观察指标[5]。以往对非手术治疗儿童髁突颈骨折愈合过程的研究一般采用动物模型进行体内实验,因缺少可连续观测的非创伤性检测手段,故难以实现对体内髁突颈骨折愈合过程进行动态观察。数学模型作为新兴的骨折愈合领域的研究工具,具备在不干涉骨折愈合过程条件下动态观察愈合过程的功能。目前已有学者利用骨折愈合数学模型替代动物模型研究骨折愈合过程[6]。

我们构建的幼年大鼠髁突颈骨折愈合数学模型基于生物调节理论,利用数学模型观察骨、软骨、成软骨细胞的生长速度、时空分布等生物特征,研究骨折愈合中骨、软骨、成骨细胞及成软骨细胞生长曲线和密度云图的动态变化,分析骨折周围骨和软骨组织变化。

1 材料和方法

1.1 构建大鼠髁突颈骨折愈合数学模型

数学模型的形状和边界条件通过动物实验确定。本研究的髁突颈骨折模型构建方法参考2010年李智提出的幼年大鼠髁突骨折动物模型[7]。选取24只雄性1月龄的Wistar大鼠,在颧弓下方做长约10 mm的皮肤切口,钝性剥离咬肌暴露髁突。使用蚊式血管钳在髁突顶部下约1.5 mm处折断髁突颈,将含有髁突的骨段向内侧轻推移位,如髁突碎片活动则证实骨折成功建立。术后第1天随机处死6只大鼠,切取半侧头部脱水脱矿后石蜡包埋,统一选择大鼠头部的矢状面制作组织切片以减少测量误差,采用Mallory’s三色染色法染色。通过在显微镜下用显微镜测尺对组织切片中髁突颈宽度、血肿厚度、骨折线长度等进行测量,并作为构建数学模型的形状和边界条件的依据(图1)。术后第7、14、28天各随机处死6只大鼠,采取相同方法制备骨折区矢状面组织切片后采用Mallory’s三色染色,骨折区拍照并用图像分析软件(Image Pro Plus V6.0)圈选并计算分析骨组织和骨痂的面积,计算二者的比值并记为骨面积比。

图1 确定数学模型的形状和边界条件Fig.1 Determine the shape and boundary condition of the mathematical model

数学模型模拟的起始时间设定在骨折后第24 h(对应于动物骨折后第1天),该时间点模拟区域内变量mc(变量mc代表软骨组织胞外基质密度)为0.01 g/mL(表示骨折后血凝块中纤维基质密度)。数学模型参照Liesbet Geris提出的生物调节理论设计模型变量和方程组。本研究将成骨细胞密度(cb)和成软骨细胞密度(cc)设为主要变量,将调控细胞活性的生长因子(成骨生长因子gb、成软骨生长因子gc)和细胞分泌的胞外基质,包括骨组织胞外基质密度用mb和软骨组织胞外基质密度用mc作为辅助变量。设置描述间充质干细胞密度的变量cm,在骨折后前3 d边界赋值cm=0.02×106/mL来模拟血肿周围组织中间充质干细胞的迁入。在骨折后前14 d边界赋值gb=200 ng/mL、gc=200 ng/mL来模拟骨膜分泌细胞因子(图1)。参考生物调节理论模型确定方程组,包含7个高偶联的非线性偏微分方程分别描述上述7个独立变量[8-9]。

1.2 数学模型运算方法

根据Lattice Boltzmann方法设定模拟区域内网格点分布,在Borland C++5.02环境下编写运算程序进行计算[10-11]。根据分析需要提取不同时间点模拟区域内各网格点上mc、mb、cc、cb变量的数值。

1.3 数学模型模拟结果分析处理

大鼠髁突颈骨折愈合数学模型在模拟骨折后28 d内每隔2 h记录一次变量mc、mb、cc、cb的数值,并且设置5个观测指标:①骨生长曲线(变量mb大于0.05 g/mL的区域占总模拟区域的百分比);②软骨生长曲线(变量mc大于0.07 g/mL的区域占总模拟区域的百分比);③成软骨细胞生长曲线(变量cc的平均值);④成骨方式(纤维/软骨基质与骨基质分层推进式生长表示膜内成骨;骨基质取代纤维/软骨基质的生长表示软骨内成骨)。

提取骨折后第7、14、21、28天时模拟区内mc、mb、cc、cb变量的数值,采用MATLAB 7.0软件分析上述数值并用不同灰度值对应各变量数值的方式绘制密度云图。以密度云图的形式将数学模型模拟的数值结果可视化,直观观察不同时间点骨、软骨、成骨细胞及成软骨细胞的分布。采用SPSS 22.0软件对数学模型模拟的骨面积比与大鼠骨折后骨面积比数据进行统计学分析。

2 结果

2.1 骨折愈合数学模型与大鼠骨折愈合指标的对比

骨折后第1天大鼠髁突颈部测量结果显示髁突颈宽度为(1.00±0.12)mm,血肿厚度为(2.20±0.28)mm,骨折线长度为(1.50±0.22)mm。大鼠骨折后第7天骨面积比为(20.80±2.32)%,对应相同时间点数学模型模拟的骨面积比为21.40%。大鼠骨折后第14天骨面积比为(79.30±6.10)%,对应相同时间点数学模型模拟的骨面积比为77.60%。大鼠骨折后第14天骨面积比为(92.00±3.85)%,对应相同时间点数学模型模拟的骨面积比为89.90%。经统计学分析,数学模型模拟结果与大鼠测量结果无显著差异(均P>0.05)。

2.2 大鼠髁突颈骨折愈合数学模型模拟结果

数学模型观察骨、软骨、成骨细胞及成软骨细胞在骨折后28 d内的变化过程,并采用密度云图显示(图2)。

图2 骨折后第7、14、21、28天骨、软骨、成骨细胞及成软骨细胞的密度云图Fig.2 Density clouds of bone,cartilage,osteoblasts and chondroblasts at 7,14,21 and 28 days after fracture

数学模型模拟的密度云图显示在骨折后第3天至第7天成骨集中在骨膜周围,在第7天至第21天成骨集中在软骨所在区域并逐渐替代软骨。骨折后第14天时形成连接骨折两端的骨桥,骨折后第28天时血肿区接近完全骨化。骨生长曲线与软骨生长曲线在骨折后第5天至第8天与第21天至第28天正相关,与第8天至第14天负相关(图3)。成骨细胞生长曲线和成软骨细胞生长曲线均呈现先升后降的趋势,成软骨细胞在第6天达到最大密度,成骨细胞则在第13天达到最大密度(图4)。

图3 骨与软骨生长曲线Fig.3 The growth curves of bone and cartilage

图4 成骨细胞与成软骨细胞生长曲线Fig.4 The growth curves of osteoblasts and chondroblasts

3 讨论

构建数学模型模拟研究骨生理是目前的研究热点,其中以生物调节理论为基础的数学模型较为成熟并应用于骨组织工程、关节退变和骨折愈合等骨生理研究[12-14]。本研究中采用的大鼠髁突颈骨折愈合数学模型参考Liesbet Geris提出的数学模型改良构建,并依据骨折后第1天大鼠髁突颈部测量结果设计模拟范围。模型模拟的骨面积比与大鼠骨折实验中骨折后第7、14、28天骨面积比无统计学差异,说明数学模型具备反映体内大鼠髁突颈骨折愈合过程的能力。数学模型模拟的结果显示髁突颈骨折后呈现的钙化组织演变过程与骨折二期愈合过程显示的变化特征十分相似[15]。骨组织胞外基质密度云图和成骨细胞密度云图显示创伤后第4天骨膜附近即出现少量片状新骨,此时骨形成方式与膜内成骨较为相似[16]。从模型模拟的第7天开始可在密度云图中观察到原先软骨组织高密度区逐渐被骨组织替代,与此同时成软骨细胞生长曲线也在相近时间达到峰值后下降,此时骨形成方式与软骨内成骨较为相似[17-18]。密度云图中骨组织替代软骨组织的顺序表现为首先在骨折断端之间形成钙化的骨桥,再沿着骨桥的边缘向内外两侧逐渐扩展的特点。

Hinton等[19]研究显示髁突骨折愈合过程中软骨形成和软骨骨化呈现单中心特征,与长骨双中心骨化有所不同。数学模型模拟显示软骨基质首先在血肿外侧积累,整体密度在第7天时达到峰值后在双侧骨皮质连接处形成骨化中心并逐渐向外侧延伸,该组织学表现与单中心软骨内成骨组织学表现相似。数学模型模拟软骨生长曲线、成软骨细胞生长曲线均呈现先上升后降低的趋势,但成软骨细胞生长曲线的峰值出现的时间较早(第6天达到峰值),而软骨生长曲线在第8天才达到峰值。该现象说明骨折愈合的过程中创伤部位先出现低分化的成软骨细胞,此阶段成软骨细胞以增殖活动为主;随着时间推移和分化程度增高,成软骨细胞继而分泌软骨基质,形成软骨组织。

相比于通过动物模型进行组织学研究,数学模型研究的优势在于可以根据研究需要随时提取模拟区组织演变的实时数据,并且提取组织演变数据后不会影响后续观察,进而实现动态观察骨折愈合过程中各类组织细胞的变化过程[14]。通过基于真实动物模型建模并对比分析模拟数据与动物实验中对应部位的组织学表现,本研究应用的数学模型可以反映体内环境下非手术治疗幼年大鼠髁突颈骨折时骨组织变化。通过动态观察髁突颈骨折愈合过程中骨与软骨相关变量的变化,验证了髁突颈骨折符合单中心骨化的二期愈合过程,从新的角度呈现该类骨折的愈合过程。