八肽胆囊收缩素对谷氨酸诱导的海马星形胶质细胞GLT-1表达的影响*

施 媛, 李明霞, 高 珊, 付 葵, 彭 坚

武汉市第三医院麻醉科,武汉 430070

脓毒症相关性脑病(sepsis associated encephalopathy,SAE)是一种由脓毒症引起的弥漫性脑疾病[1]。SAE患者的死亡率极高,但SAE的发病机制仍不清楚[2]。研究认为,血脑脊液屏障损伤、脑血管功能障碍、氧化应激、炎症损伤、线粒体功能障碍等与SAE的发病机制密切相关,其中炎症损伤是目前证据最为确凿的假说之一,因此研究如何有效抑制SAE中的炎症反应对于SAE病情的缓解和治疗至关重要[3]。

胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)是一种脑肠肽,参与中枢神经系统中学习和记忆等多种生物功能的调节[4]。CCK有多种亚型,其中八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)是具有CCK完全功能的最小活性片段,被证实参与多种动物模型中炎症反应的调节,提示CCK-8可能参与SAE中炎症反应的调节[5-6]。研究表明,谷氨酸(glutamate,Glu)作为一种兴奋性神经递质,在神经元信息传递中发挥重要作用,Glu过度积累会引发Glu兴奋性毒性反应,引起神经元损伤[7]。通过谷氨酸转运体(glutamate transporter,GLT)对细胞外Glu进行重摄取是改变细胞外Glu浓度的主要途径,其中GLT-1是众多转运体亚型的一种,可通过转运多余Glu来保护神经元[8]。综上,本研究假设CCK-8能够抑制炎症反应,促进GLT-1的表达,降低细胞外Glu的浓度,发挥神经元保护作用。为验证此假设,本研究用不同浓度的CCK-8处理Glu诱导的星形胶质细胞,明确CCK-8对GLT-1表达和Glu水平的影响,为SAE的诊断和治疗提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

CCK-8购自源叶生物(S80567),L-谷氨酸购自阿拉丁公司(G103978),DMEM/F12培养液购自Hyclone公司(SH30023.01),DMSO购自Sigma公司(D2650),MTT购自Solarbio公司(M1025),凋亡检测试剂盒购自BD公司(556547),Glu测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所(A074-1-1),小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒、兔抗Caspase-3、Bcl-2、GLT-1、GLAST、GAPDH和HRP标记的山羊抗兔二抗购自武汉Bioswamp公司(MU30030、PAB33236、PAB30041、PAB30235、PAB32626、PAB36269、SAB43714),SYBR染料购自美国KAPA Biosystems公司,逆转录试剂盒购自TaKaRa公司。

1.2 小鼠海马星形胶质细胞的分离和培养

小鼠海马星形胶质细胞的体外原代培养参考Mccarihy法并加以改进[9]。取新生1～3 d的C57BL/6小鼠,消毒、开颅、剔除血管及脑膜分离出海马,用预冷的含2%双抗的PBS冲洗3遍,海马组织剪成直径2 mm左右的碎块,胰酶消化至无明显组织块,离心,加入DMEM/F12培养液终止消化,制成单细胞悬液,差速贴壁40 min,按106个/mL密度以含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液接种。将接种细胞置于37 ℃,5% CO2的孵箱中培养7～9 d,待细胞融合度达到70%～80%时,将培养瓶置于恒温(37℃)旋转摇床上以240 r/min的转速摇18 h后,进行传代培养即得纯化的小鼠海马星形胶质细胞。

1.3 不同浓度CCK-8对小鼠海马星形胶质细胞的毒性检测

将小鼠海马星形胶质细胞接种于96孔板,每孔3×105个细胞,过夜培养使细胞贴壁,分别用0.1、0.5和1.0 μmol/L的CCK-8处理细胞,培养30 min[10],每组设置3个复孔,并设置空白对照组,处理完成后加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL),培养4 h后去上清,加入150 μL DMSO溶解液,摇床振荡10 min,酶标仪检测490nm处的吸光值(A490nm)。

1.4 细胞分组及处理

将细胞分成5组:对照组、Glu组、Glu+0.1 μmol/L CCK-8组、Glu+0.5 μmol/L CCK-8组、Glu+1.0 μmol/L CCK-8组。对照组不作处理;Glu组用1 mmol/L的Glu作用10 s;其余组先用CCK-8预处理30 min,再加入1 mmol/L的Glu作用10 s[11]。处理完成后以MTT法检测细胞增殖能力。

1.5 流式检测细胞凋亡

取各组处理完成的细胞,400×g、4℃离心5 min,弃上清,预冷的PBS洗涤细胞后重悬于200 μL PBS,加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI,混匀后4℃避光孵育30 min,加入300 μL PBS,随即进行流式检测。

1.6 生化试剂盒检测细胞中Glu含量

将各组处理完成的细胞悬液加入培养皿中培养24 h,按照谷氨酸测试盒说明书检测小鼠海马星形胶质细胞中Glu的含量。

1.7 qRT-PCR检测GLT-1和GLAST mRNA的表达

Trizol法提取各组细胞总RNA,逆转录合成cDNA,进行实时荧光定量PCR。扩增体系:SYBR染料10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O定容至总体积20 μL。反应程序:预变性95℃ 3 min,扩增95℃ 5 s,56℃ 10 s,72℃ 25 s,共40个循环。反应结束后,以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCt法计算GLT-1和GLAST mRNA的表达水平。

1.8 Western blot检测Caspase-3、Bcl-2、GLT-1和GLAST蛋白的表达

提取各组细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,取20 μg蛋白进行10% SDS-PAGE凝胶电泳,将蛋白湿转至PVDF膜,5%脱脂奶粉37℃封闭2 h,加入1∶1000稀释的Caspase-3、Bcl-2、GLT-1、GLAST和GAPDH一抗,4℃孵育过夜,次日加入1∶20000稀释的二抗,37℃孵育1 h,ECL显影,曝光,用Image Pro Plus 7.0软件分析条带灰度值。

1.9 ELISA检测细胞上清中TNF-α的水平

收集各组处理完成的细胞上清,采用小鼠TNF-α ELISA试剂盒检测各组细胞上清中TNF-α的水平,具体操作按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度CCK-8对小鼠海马星形胶质细胞增殖的影响

与对照组相比,0.1、0.5和1.0 μmol/L的CCK-8对小鼠海马星形胶质细胞的增殖均无明显影响(均P>0.05)。见图1。

图1 CCK-8对小鼠海马星形胶质细胞增殖的影响Fig.1 Effect of CCK-8 on the proliferation of mouse hippocampal astrocytes

2.2 不同浓度CCK-8对Glu诱导的小鼠海马星形胶质细胞增殖的影响

与对照组相比,Glu组细胞增殖能力显著降低(P<0.01);与Glu组相比,0.1 μmol/L CCK-8干预对细胞增殖能力无显著影响(P>0.05),而0.5和1.0 μmol/L CCK-8干预均能显著促进星形胶质细胞增殖(P<0.05,P<0.01)。见图2。

与对照组比较,**P<0.01;与Glu组比较,△P<0.05 △△P<0.01

2.3 不同浓度CCK-8对Glu诱导的小鼠海马星形胶质细胞凋亡的影响

与对照组相比,Glu组细胞凋亡率显著升高(P<0.01);与Glu组相比,不同浓度的CCK-8干预均能显著降低细胞凋亡率(均P<0.01)。见图3。

与对照组比较,**P<0.01;与Glu组比较,△△P<0.01

2.4 不同浓度CCK-8对Glu诱导的小鼠海马星形胶质细胞中Glu含量的影响

与对照组相比,Glu组细胞中Glu含量显著升高(P<0.01);与Glu组相比,不同浓度的CCK-8干预均能显著降低细胞中Glu含量(均P<0.01)。见图4。

与对照组比较,**P<0.01;与Glu组比较,△△P<0.01

2.5 不同浓度CCK-8对Glu诱导的小鼠海马星形胶质细胞中GLT-1和GLAST mRNA表达的影响

与对照组相比,Glu组细胞中GLT-1和GLAST mRNA表达水平显著降低(均P<0.01);与Glu组相比,0.1 μmol/L CCK-8干预对细胞中GLT-1和GLAST mRNA表达水平无显著影响(均P>0.05),而0.5和1.0 μmol/L CCK-8干预均能显著上调细胞中GLT-1和GLAST mRNA的表达水平(P<0.05,P<0.01)。见图5。

与对照组比较,**P<0.01;与Glu组比较,△P<0.05 △△P<0.01

2.6 不同浓度CCK-8对Glu诱导的小鼠海马星形胶质细胞中Caspase-3、Bcl-2、GLT-1和GLAST蛋白表达的影响

与对照组相比,Glu组细胞中Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.01),Bcl-2、GLT-1和GLAST蛋白表达水平显著降低(均P<0.01);与Glu组相比,不同浓度的CCK-8干预均能显著下调细胞中Caspase-3蛋白表达水平,并显著上调Bcl-2、GLT-1和GLAST蛋白表达水平(均P<0.05)。见图6。

与对照组比较,**P<0.01;与Glu组比较,△P<0.05 △△P<0.01

2.7 不同浓度CCK-8对Glu诱导的小鼠海马星形胶质细胞上清中TNF-α水平的影响

与对照组相比,Glu组细胞上清中TNF-α水平显著升高(P<0.01);与Glu组相比,不同浓度的CCK-8干预均能显著降低细胞上清中TNF-α水平(均P<0.01)。见图7。

与对照组比较,**P<0.01;与Glu组比较,△△P<0.01

3 讨论

星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞,具有支持神经元活动和维持中枢神经系统稳态的关键作用[12]。本研究用Glu诱导海马星形胶质细胞损伤,结果显示,高浓度的Glu能够抑制星形胶质细胞的增殖,并促进细胞凋亡,与前期研究结果一致[13],而CCK-8干预能够逆转Glu对星形胶质细胞产生的损伤,表明CCK-8对Glu诱导的海马星形胶质细胞具有保护作用。此外本研究还检测了凋亡相关蛋白Bcl-2和Caspase-3的表达,其中Bcl-2是一种抗凋亡蛋白,而Caspase-3是凋亡的关键执行者[14],结果显示,过量的Glu能够上调星形胶质细胞中Caspase-3的表达并下调Bcl-2的表达,而CCK-8干预能够逆转Caspase-3和Bcl-2的表达,这表明CCK-8能够通过调控凋亡相关蛋白的表达来抑制星形胶质细胞的凋亡。

研究表明,星形胶质细胞的基本功能之一是摄取大部分突触释放的Glu,防止Glu兴奋性毒性。在中枢神经系统,Glu的清除是由GLT介导的,且这些转运体主要由星形胶质细胞表达[15]。GLT-1和GLAST是GLT的亚型,负责90%以上Glu的摄取,主要分布在星形胶质细胞表面,对维持Glu神经信号的正常传递具有重要作用[16]。多项研究表明,GLT-1和GLAST与多种神经系统疾病密切相关。Ramandi等[17]发现癫痫急性期大鼠Glu水平升高,且GLT-1的表达下调,而服用药物后,Glu水平降低,GLT-1的表达上调。马宇昕等[18]发现GLAST在阿尔兹海默病模型小鼠中的表达降低,而药物干预治疗后GLAST的表达上调。本研究结果显示,Glu处理能够抑制GLT-1和GLAST的表达,而CCK-8干预能够降低Glu水平,并上调GLT-1和GLAST的表达,与上述研究结果一致,提示CCK-8能够通过上调Glu诱导的星形胶质细胞中GLT-1和GLAST的表达来降低细胞外Glu的水平,从而缓解细胞损伤。

既往研究证明,脓毒症并发症可诱发神经炎症反应,导致临床预后不良[19]。SAE的发病机制与神经炎症有着密不可分的联系,神经炎症是导致神经元、内皮细胞和小胶质细胞功能障碍和大量凋亡的主要原因[20]。局部和外周炎症都是由固有的大脑免疫细胞,特别是小胶质细胞的激活引起的。激活的小胶质细胞可以释放大量的炎症介质,炎症介质释放后会进一步加重神经炎症[21]。研究表明,炎症因子TNF-α能够调节GLT-1的表达,在SAE的发病机制中发挥重要作用[22-23]。Song等[24]研究发现抑制TNF-α表达能够保护神经元免受Glu诱导的细胞死亡。本研究结果显示,Glu处理能够促进星形胶质细胞释放TNF-α。而CCK-8干预后,TNF-α的释放受到抑制,表明CCK-8能够通过抑制Glu诱导的星形胶质细胞的炎症反应,进而可能以此调控GLT-1的表达。

综上所述,CCK-8能够抑制Glu诱导的星形胶质细胞的炎症反应,促进GLT-1的表达,降低细胞外Glu的浓度,从而抑制细胞凋亡并促进其增殖。